不同流動相組成對雌馬酚對映體拆分的影響

羅云，張文靜，張洪亮，徐進

（1.溫州大學 化學與材料工程學院，浙江 溫州325035； 2.大慶師范學院，黑龍江 大慶 163458）

雌馬酚（Equol），淡黃色粉末，分子式為C15H4O3，相對分子質量為242.7，化學名稱為3-(4-羥基苯基)四氫苯并吡喃-7-醇，結構式如圖1 所示。它屬于非甾體雌激素類，具有兩種對映體形式，即S-雌馬酚和R-雌馬酚，結構式如圖2 所示。

圖1 雌馬酚對映體的結構式

圖2 雌馬酚單一對映體的結構式

雌馬酚是高度親油性的，這使得它在水中極不溶。它的熔點約為189～190 ℃[1-2]。雌馬酚被認為是所有大豆異黃酮中最活躍的代謝物，與前體大豆異黃酮相比，它具有更高的抗氧化和雌激素活性[3-5]，對抗腫瘤、抗氧化活性、抗炎活性、心血管保護等都具有一定作用。研究表明，S-雌馬酚對雌激素受體β的選擇性親和力比R-雌馬酚高11 倍左右。另外，不同的對映體在生物活性方面表現出多樣性，這表明它們適合多種臨床應用[6]。目前，大豆異黃酮已經被廣泛研究，雌馬酚是大豆異黃酮在體內的主要活性代謝物。越來越多的證據表明，大豆異黃酮通常不會直接發揮雌激素活性，而大豆異黃酮的最終腸道代謝產物S-雌馬酚具有較高的雌激素活性，現已被廣泛研究[7-8]。但是，據推測，飲食習慣和遺傳因素也會影響體內的雌馬酚的產生。因此，在體外生產雌馬酚的方法不斷發展。所以，對雌馬酚的拆分研究極其重要。

對雌馬酚的拆分是通過高效液相色譜法進行的，色譜技術是利用不同物質對固定相有不同的吸附解析能力導致的保留時間不一樣，來達到分離的目的[9]。批處理分離方法憑借分離穩定、快速、成本低等優勢應用在各個化工領域的生產中[10]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

雌馬酚對映體（＞98%），上海畢得醫藥科技有限公司；正己烷（95%）和無水乙醇（99.9%），HPLC級， 百靈威科技公司； 1,3,5- 三叔丁基苯（TTBB），＞98%，TCI；Chiralpak AD 柱（100 mm×10 mm，20 μm），大賽璐手性技術公司；高效液相色譜儀，Agilent 1260，Agilent 公司；Sartorius BSA224SCW 電子天平；Julabo F34-ED 超級恒溫水浴；德國Brand 電子移液槍；SB-4200D 超聲波清洗機。

1.2 雌馬酚對映體紫外全波長掃描實驗

使用紫外可見分光光度計對配制好的25 mL 0.01 g·L-1雌馬酚對映體溶液進行200～500 nm 波段全波長掃描，取同一容量瓶中準備好的兩份樣品進行實驗。

1.3 色譜條件

Chiralpak AD 手性制備柱，正己烷與乙醇體積比例分別為80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40 的流動相，在實驗過程中用中央空調和水浴控溫為25 ℃。

1.4 泵流量的校正實驗

高效液相色譜的泵的精準性不是固定不變的，會因為使用磨損等原因使其存在一定的誤差，所以在實驗之前要對泵的流量進行校正。本實驗所用的高效液相色譜Aglient 1260 是二元泵，假定為A 泵、B 泵，需要對其分別進行校正。

因流動相的配比對泵流量的校正實驗沒有影響，所以選取流動相為正己烷、乙醇（體積比80∶20）進行實驗。

1.5 色譜系統管路死體積和色譜柱孔隙率的測定實驗

0.50 g·L-1TTBB 溶液和0.50 g·L-1雌馬酚對映體溶液的配制：分別用分析天平稱取0.012 5 g 的TTBB和雌馬酚于小燒杯中，然后用配置好的流動相進行溶解，轉移至25 mL 容量瓶中進行定容，搖勻后標記待用。對高效液相色譜系統死體積和色譜柱孔隙率采用以TTBB 作為示蹤劑的示蹤法進行測定。

1.6 雌馬酚對映體線性吸附常數的測定實驗

用正己烷與乙醇體積比分別為80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40 的流動相分別配置0.5 g·L-1的雌馬酚溶液備用。開啟儀器，設置紫外波長為280 nm，在二通連接的狀態下用正己烷、乙醇（體積比80∶20）作為流動相將系統基線沖至平穩；打開恒溫水浴，調整溫度為25 ℃，將流動相、色譜柱、雌馬酚溶液以及系統管路放進水浴中恒溫至少1 h；溫度穩定之后，采取針進樣的方式，每次進樣0.5 g·L-1的雌馬酚溶液20 μ雌，采集在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL·min-1流速下的數據；流動相將系統基線沖至平穩，將流動相換為下一組配比重復步驟實驗并分別保存數據。

2 結果與討論

2.1 雌馬酚對映體紫外全波長掃描實驗結果

對兩次的掃描結果進行處理，取平均值進行做圖，得出雌馬酚的最佳紫外吸收波長在225 nm 和280 nm 左右，本文選擇敏感波長280 nm 進行線性實驗。雌馬酚的紫外全波長掃描圖如圖3 所示。

圖3 雌馬酚的紫外全波長掃描圖

2.2 泵流量的校正實驗結果

通過對實驗得到的A 泵和B 泵數據進行處理可以得到二者在固定條件下的實際流量，將實際流量和設定流量進行做圖，可以得到校正曲線。

通過兩個泵的校正曲線可以看出，設定流量和試劑流量還是有一定誤差的，所以，在后續的實驗中，按照校正曲線進行流量的設定，例如A 泵需要流量為1 mL·min-1時，則設定值為1.028 mL·min-1。

2.3 色譜系統管路死體積和色譜柱孔隙率的測定實驗結果

對所獲得的以TTBB 為示蹤劑的實驗數據進行處理，因TTBB 所流出的峰并不是對稱的，所以流出時間采用公式（3）進行計算。

再根據公式（4），以1/Q和μt分別為橫坐標和縱坐標作圖，即可得出系統死體積。

可得兩個泵的曲線方程如下。

從A 泵和B 泵的曲線方程可以得到，系統死體積V0為0.35 mL。

色譜柱的孔隙率εt是進行后續色譜分離實驗的一個重要的基礎參數，也是以后對數據進行擬合時所需要的重要參數[11]，所以，對孔隙率的測定一定要準確。以TTBB 作為示蹤劑，通過公式（7）直接求得色譜柱總空隙率εt。

式中：t—色譜柱連接時TTBB 的流出時間，min；

tplant—二通連接時TTBB 的流出時間，min；

Q—流速，mL·min-1；

Vcol—色譜柱總體積，mL。

根據V=Qt，聯立式（7），可得式（8）：

式中：V1—系統管路死體積V0和色譜柱的死體積之和。

已經求出了系統管路死體積V0，按照同樣的方法對接有色譜柱的數據進行處理做圖，就能得出V1。A 泵測得的系統管路與色譜柱死體積如圖4 所示，B 泵測得的系統管路與色譜柱死體積如圖5 所示。

圖4 A 泵測得的系統管路與色譜柱死體積

圖5 B 泵測得的系統管路與色譜柱死體積

由圖4 和圖5 可得兩個泵的曲線方程如下。

從A 泵和B 泵的曲線方程可以得到，系統死體積和色譜柱死體積一共為V1=5.94 mL。色譜柱死體積為V1減去V0為5.59 mL，通過色譜柱基礎參數得出Vcol=7.85 mL，則根據式（8）可以得出εt=0.712。

2.4 雌馬酚對映體線性吸附常數的測定實驗

本實驗在預設的5 個不同的流動相配比下，通過進樣濃度較低的對映體溶液在不同的流速下進行實驗，對得到的流出曲線數據進行處理，得到各個條件下的亨利常數和柱效。圖6 是雌馬酚對映體的流出曲線，從圖6 中可以看出，兩種單一對映體的分離度不是很高，不能達到基線分離，所以采用式（11）和（12）來計算單一對映體的停留時間tR和N。

圖6 線性條件下的雌馬酚分離譜圖

式中：tR,i—保留時間；

?—孔隙率；

uint—色譜柱線流速；

L—色譜柱長度；

W2/h—半峰寬；

α—約為5.54。

雖然雌馬酚對映體溶液無法達到基線分離，對于半峰寬的計算可以通過先得出半峰寬的一半，將其乘以2 來計算出準確的半峰寬數據，再通過公式（12）可以得到各個單一對映體的理論塔板數。對于設定好的溫度、流動相配比等條件，對tR.i和1/Q作圖如圖7 和圖8 所示，通過得到的直線斜率來求出組分i在此條件下的亨利常數。

圖7 1/Q 對t 作圖確定亨利常數

圖8 1/Q 對t 作圖確定亨利常數

通過以上對數據的處理，可以得到各個條件下的Hi和Ni。

在不同流動相組成下的線性脈沖實驗數據處理所得到的結果匯總于表1。

表1 線性脈沖實驗計算結果

3 結 論

利用5 個不同組成的流動相使用Chiralpak AD柱對雌馬酚對映體進行測定，以泵流量的測定、系統死體積的測定以及色譜柱孔隙率的測定作為基礎，通過對不同組成流動相雌馬酚對映體的流出曲線進行分析計算，得出在不同流動相下的柱效和亨利常數等參數。本研究對后續探究通過逆向法不同組成流動相對模型參數的影響，以及在考慮溫度的基礎上加上溶解度對模型參數的影響的探究提供了有效的基礎數據，具有重要意義[12]。