優質輕簡高效生產技術（八） 植物根際促生菌液態發酵菌劑的制備與蔬菜苗期應用技術

穆文強 尚慶茂 康慎敏 李平蘭*

（1 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2 中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業農村部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100081）

植物根際促生菌是一類生活在植物根際，或附著于根系表面，或生活在植物體內的微生物，能夠促進植物對礦質養分的吸收利用，抑制和拮抗病原菌生長，分泌植物生長激素，促進植物生長（穆文強 等，2022）。目前，國內已商品化的植物根際促生菌菌劑有液態發酵和固態發酵兩種生產方式。液態發酵相比于固態發酵具有速度快、周期短、產量高、均勻性好、便于機械化操作、發酵過程易于控制、菌體可與培養基分離、菌量密度高等優點。筆者對植物根際促生菌菌劑液態發酵原料的選擇、生產工藝、質量要求等進行介紹，并總結植物根際促生菌菌劑在蔬菜苗期的應用方法和效果，以期為植物根際促生菌菌劑的制備和應用提供參考。

1 原料選擇

1.1 碳源 碳源是根際促生菌能正常生長與分裂的物質基礎，也是構成根際促生菌發酵培養液的重要組成部分。常見的碳源有碳水化合物、脂肪、有機酸、醇類等，根際促生菌發酵多以碳水化合物作為碳源，常見的有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉等（表1）。葡萄糖是最容易被利用的碳源，幾乎所有的根際促生菌都可以直接利用，其作為發酵培養基的成分，是一種速效碳源，可以加速根際促生菌的生長。糖蜜是制糖工業的副產物，含有豐富的糖、無機鹽和維生素等，營養豐富且價格低廉，是根際促生菌液態發酵的主要碳源之一。

1.2 氮源 氮源在根際促生菌發酵中主要用于合成細胞物質（氨基酸、蛋白質、核酸等）和含氮代謝產物，以促進菌體的生長。氮源可分為有機氮源和無機氮源兩大類。液態發酵常用的可溶性有機氮源有花生餅粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、蛋白胨等（表1）。有機氮源成分比較復雜，含有一些糖類、脂肪、無機鹽、維生素以及某些生長因子，可以滿足根際促生菌對多種營養物質的需求。常用的無機氮源有銨鹽、硝酸鹽和氨水等（表1）。無機氮源的吸收利用速度較快，消耗過快會使發酵體系的pH 發生改變，實際使用中要注意發酵罐pH 的變化，及時進行補料。

1.3 礦質元素 根際促生菌在生長、繁殖過程中需要磷、硫、鎂、鉀、鈉、鈣、鐵、錳等無機鹽和微量元素，在較低濃度下無機鹽和微量元素對根際促生菌的生長具有促進作用，可以構成活性物質、調節生理活性和滲透壓等（表1）。在芽孢桿菌液態發酵過程中，適量地添加硫酸鎂、碳酸鈣、氯化錳可以提高根際促生菌芽孢的形成率，有利于菌劑的儲存。

表1 植物根際促生菌菌劑液態發酵所需的基本營養物質

1.4 代謝調節物質 在發酵過程中加入生長因子、代謝抑制劑、代謝促進劑、前體物質、輔因子等代謝調節物質，有助于調節根際促生菌的生長和產物的形成。

1.5 消泡劑 在發酵過程中，培養基成分的特點、根際促生菌自身的特性以及攪拌和供氧，會使發酵液產生大量泡沫，若泡沫得不到及時控制，易造成生產設備出現漫溢現象，進而影響生產過程控制和設備操作，以及產品質量，嚴重時會對設備造成腐蝕。常見的消泡劑種類有脂肪類、聚醚型、有機硅型、聚醚改性有機硅型（胡楠 等，2021）。

2 生產工藝

2.1 菌種選擇 選擇安全、適合生產、抗病、促生等性能優異的菌種，多菌株復合發酵時需要保證菌株的最適生長條件與培養參數相近，且菌株間無拮抗作用。

2.2 生產車間及環境要求 發酵車間與吸附等后處理車間保持一定的距離，相對隔離；發酵菌種的儲藏間、無菌操作間與生產車間距離適當，防止儲藏菌種被污染；發酵車間、控制車間等關鍵性生產車間，應采用雙路供電或用一套發電機，防止因意外停電對生產造成損失；無菌操作間應配置更衣室區域，生產人員進入無菌操作間進行操作的流程：①進入操作間門并脫去外套，將個人衣物存放在衣柜內，填寫無菌操作間進出登記表，在更衣室內脫去較厚的衣服，雙手浸泡消毒，按照順序戴好口罩，穿戴無菌工作服，戴好手套，方可進入清潔區域。② 工作完畢后，將廢料、使用過的器皿等集中在一起，對內部環境進行打掃，操作員在退出無菌操作間之前，將垃圾推向緩沖間，然后去更衣室換回自己的衣服。③在無菌操作間內，工作人員不能同時開啟兩扇門進出，要做到隨手關門；更衣室不能逆向進入；工作人員一旦進入污物區后，不得直接返回無菌操作間。離開無菌操作間時應打開紫外燈，每周用過氧乙酸、新潔爾滅等消毒劑對操作間地板進行消毒與清洗。

生產車間應保持整潔，在生產過程中采用蘸有過氧乙酸、新潔爾滅等消毒劑的抹布除去發酵罐外表的液體，保持發酵罐的清潔。廠區空氣質量應符合GB 3095—1996《環境空氣質量標準》中Ⅱ類標準要求，發酵用水應達到GB 3838—2002《地表水環境質量標準》中Ⅲ類標準要求，冷卻水及其他用水等應符合GB 3838—2002《地表水環境質量標準》中Ⅳ類水質要求。

2.3 設備滅菌

2.3.1 高壓滅菌 滅菌效果的好壞直接關系到發酵工藝是否能正常進行、產品是否合格，由于工業發酵設備的特點，普遍采用濕熱蒸汽滅菌法。高溫蒸汽使液體培養基、補料罐（包括培養基成分、酸、堿、消泡劑等）、管道、發酵設備溫度上升到120℃左右，發酵罐壓力維持在90～100 kPa（表壓），并保持20～30 min（分）。液體培養基裝料最大不超過發酵罐容積的80%。在對高溫滅菌過程中會產生對菌體生長有害物質或易受高溫破壞的物料進行滅菌時，應對該原料單獨采用其他方式滅菌后進行混合，或適當降低滅菌溫度和氣壓，同時延長滅菌時間。

2.3.2 空氣質量要求 不同菌種由于生長速度快慢、發酵周期長短等差異，對空氣質量要求不同；不同的生產車間對空氣質量要求也不同，如控制區要求空氣菌落數≤ 10 CFU·mL，潔凈區要求空氣菌落數≤ 1 CFU·mL，測定方法：9 cm 肉湯固體培養基平板露置30 min（分）后，37 ℃培養24 h（小時），觀察培養基內菌落數。發酵過程中需要的無菌空氣需滿足NY/T 883—2004《農用微生物菌劑生產技術規程》中的要求。

2.4 發酵過程控制 植物根際促生菌菌劑液態發酵工藝流程如圖1 所示。

圖1 植物根際促生菌菌劑液態發酵工藝流程

2.4.1 接種量 種子發酵罐接種種子液的接種量應在0.5%～5.0%范圍內；在多級發酵生產階段，對于生長繁殖快的菌種〔世代時間＜ 3 h（小時）〕，從一級種子罐轉向二級種子罐的接種量宜為5%～10%；對于生長繁殖較慢的菌種〔世代時間＞6 h（小時）〕，接種量不宜低于10%。

2.4.2 發酵溫度 在發酵過程中可根據不同的目的產物、根際促生菌的生長和代謝特性，采用不同溫度進行生產發酵，常見溫度多為30～40 ℃。

2.4.3 供氧 根際促生菌多為好氧代謝菌株，在發酵過程中需保證培養基有足夠的溶氧。根據發酵罐的特點，將供氧口設計在發酵罐底部，底部供氧可使氧氣與液體培養基充分接觸，與發酵罐的攪拌相配合，可最大限度地提高培養基中的溶氧量。

2.4.4 發酵終點判斷 在發酵末期，根際促生菌的生長和代謝能力逐漸降低或停止，部分菌體開始衰老進入自溶階段。下罐的時間對產品的質量有重要影響，在實際生產中，經濟因素和質量因素是影響下罐時間的主要因素。可通過監測發酵液的酸堿度、溶氧量、透光率及黏度等理化參數作為判定發酵終點的依據；對于芽孢桿菌，可通過鏡檢觀察菌體的形態、密度，要求芽孢桿菌發酵結束時芽孢形成率≥ 85%，便于后期儲存。

2.5 后處理 后處理工藝大致分為兩種方式：①發酵物直接分裝或稀釋后分裝，形成液體產品；②發酵物與載體物料混合吸附，轉化為固態、粉末狀終端產品。

常見載體物料有草炭、泥炭、腐殖酸、黃腐酸、蛭石等，應滿足NY/T 798—2015《復合微生物肥料》的規定，糞大腸菌數≤ 100 CFU·g；蛔蟲卵死亡率≥ 95%；鉻（Cr）≤ 150 mg·kg；鉛（Pb）≤50 mg·kg；砷（As）≤ 15 mg·kg；鎘（Cd）≤3 mg·kg；汞（Hg）≤ 2 mg·kg。

根際促生菌發酵液與吸附載體物料應混合均勻。混合時可添加一定量的保護劑或采取適當措施，以減少菌體的死亡。常見的保護劑有蔗糖、海藻糖、脫脂乳、可溶性淀粉等（Zhang et al.，2020；Nizar et al.，2022）。吸附和混合環節應注重無菌化操作，減少雜菌污染。

2.6 建立生產檔案 每批產品的生產和檢驗結果都要有檔案記載，內容包括產品的檢驗項目信息、檢驗結果、檢驗人信息、審定人信息、檢驗日期信息等。

2.7 產品質量跟蹤 定期對產品質量進行檢查，并建立產品申報檔案，對產品申報情況進行跟蹤。

3 質量要求

以每個發酵罐生產的菌液為1 個批次，進行產品抽樣檢測，并要求無菌操作。

3.1 菌量 要求菌液的有效活菌數≥ 2 × 10CFU·mL，霉菌雜菌數≤ 3 × 10CFU·mL，雜菌率≤ 10%。經過后處理形成粉末劑型的根際促生菌菌劑產品，要求有效活菌數≥ 2 × 10CFU·g，霉菌雜菌數≤ 3 × 10CFU·g，雜菌率≤ 20%，水分≤ 35%，細度≥ 80%。對于多菌株復合菌劑，要求每一種有效菌的含量≥ 1 × 10CFU·g（或CFU·mL）。

高活性、高數量的根際促生菌菌劑應符合NY/T 3083—2017《農用微生物濃縮制劑》要求，有效活菌數≥ 2 × 10CFU·g（或CFU·mL），雜菌率≤ 1.0%，霉菌雜菌數≤ 3 × 10CFU·g。

3.2 糞大腸菌群數 應符合GB 20287—2006《農用微生物菌劑》的規定，糞大腸菌數≤ 100 CFU·g（或CFU·mL）。

3.3 蛔蟲卵死亡率 應符合GB 20287—2006《農用微生物菌劑》的規定，蛔蟲卵死亡率≥ 95%。

3.4 重金屬含量 應符合GB 20287—2006《農用微生物菌劑》的規定，鉻及其化合物含量（以Cr計）≤150 mg·kg，鉛及其化合物含量（以Pb計）≤ 100 mg·kg，砷及其化合物含量（以As計）≤ 70 mg·kg，鎘及其化合物含量（以Cd計）≤ 10 mg·kg，汞及其化合物含量（以Hg計）≤ 5 mg·kg。

4 包裝、標識、運輸、儲存和操作安全性

4.1 包裝 液體菌劑的包裝采用瓶或桶灌裝，以mL 或L 為容積單位，經過吸附后的粉末菌劑采用袋裝包裝，以g 或kg 為質量單位，實際量不得低于包裝標注量。

4.2 標識 包裝袋上應印有植物根際促生菌種名稱、活菌數、合格標識、商標、產品名稱、生產廠家名稱、地址、電話、產品質量（g 或kg）、生產日期、有效期、執行標準、生產批號、產品標準編號。

4.3 運輸 運輸途中要有遮擋物，防止雨淋、太陽暴曬及溫度過高。嚴禁與其他有毒有害的物品混放或混在一起運輸。裝卸貨時，要做到輕裝輕卸，以免發生包裝破損的情況。

4.4 儲存 產品不能露天堆放，應存放于庫房或倉庫，保證儲存環境陰涼（避光）、干燥、通風，防日曬雨淋，防35 ℃以上的高溫長期暴曬，避免惡劣條件。

4.5 操作安全性 根際促生菌菌劑的生產應符合國家勞動安全、機械設備操作、用電、消防等相關法規，確保操作人員生命安全。

5 常用植物根際促生菌液態發酵菌劑

目前，我國已商品化、用于蔬菜的根際促生菌劑多為芽孢桿菌，還有少量霉菌，廣泛用于黃瓜、番茄、辣椒、白菜等蔬菜生產（表2）。

表2 植物根際促生菌液態發酵制劑主要商品化產品

6 蔬菜苗期應用根際促生菌菌劑的方法和效果

6.1 應用方法 蔬菜苗期應用根際促生菌菌劑主要有3 種方法，即：種子處理、基質混拌、灌溉施入。

6.1.1 種子處理 該方法是將促生菌粘附在種子表皮，對粉劑菌劑較為適用，液體菌劑效果較差，要求含菌量為1 × 10～1 × 10CFU·mL。優點是很容易實現，不需要復雜的操作；根際促生菌可較好地定殖在種子附近，利用率最高。缺點是種子無法與殺蟲劑、消毒劑等進行拌種，粘合劑會降低微生物的活性（John et al.，1988）。

6.1.2 基質混拌 該方法是在基質主原料混拌時加入根際促生菌菌劑，對粉劑菌劑和液體菌劑均適用，根際促生菌在育苗基質中的添加量宜為1 × 10～1 × 10CFU·mL，添加量過大會增加生產成本，降低內源性植物激素水平（楊會款，2020）。優點是應用場景較廣、操作簡單，基質工廠、育苗場均可完成菌劑與基質的混拌；根際促生菌作用時間長；采用穴盤育苗的蔬菜均適用。缺點是若根際促生菌在基質中混拌不均勻，易造成幼苗長勢不一致。

6.1.3 灌溉施入 液體菌劑直接灌溉或稀釋后灌溉，粉末菌劑需提前加入一定量水進行溶解，稀釋后方可施用，含菌量多為1 × 10～1 × 10CFU ·mL。該方法的優點是操作簡單，可在灌溉時加入根際促生菌，對蔬菜幼苗做到水分和菌劑的同時補充；可根據蔬菜幼苗長勢和生長期長短，單次或多次灌溉施用。缺點是未用完的液體菌劑不易保存。

6.2 應用效果

6.2.1 促進蔬菜幼苗生長發育 賀字典等（2020）采用解磷圈法從15 株植物根際促生菌中篩選透明圈直徑最大的解磷菌菌株LZT-5（不動桿菌）和FQG-5（嗜麥芽寡養單胞菌），采用育苗基質添加和灌根方式，測定解磷菌對幼苗期和成株期番茄促生作用及根圍土壤養分的影響。結果表明，育苗基質中加入10%的FQG-5 和LZT-5 后，番茄幼苗株高、莖粗和葉面積顯著高于其他處理；FQG-5 灌根后番茄根圍的速效磷、速效鉀、硝態氮、有機質、全氮、全磷、全鉀含量均顯著高于其他處理，表明解磷菌可以促進番茄根圍土壤養分轉化成速效性養分，從而促進番茄植株生長，提高產量。

梁建根等（2007）用CH1（短短芽孢桿菌）、CH2（枯草芽孢桿菌）3 × 10CFU·mL菌懸液浸泡黃瓜種子30 min（分），顯著促進了黃瓜種子萌發和植株生長，減少了根系和葉片中活性氧和丙二醛積累。

6.2.2 增強非生物逆境抗性 鄭娜等（2018）從鹽堿地和重金屬污染地篩選出的4 株菌株TM1109（）、KY5104（sp.）、TY4204（sp.）和KY4410（），在0.7%鹽脅迫下對番茄鮮質量增長效果好，增長率為33%～50%。鹽耐受機制研究結果顯示：TY4204 和KY5104 通過誘導或增強SOD 和POD 活性來清除番茄體內氧自由基對番茄的損傷，也可以合成ACC 脫氨酶抗鹽脅迫，同時通過降低葉片中MDA 含量來減輕番茄在鹽脅迫下的損傷。TM1109 和KY4410 雖然不產生ACC 脫氨酶，IAA 產量水平也較低，但可以在鹽脅迫下通過誘導或增強SOD 和POD 活性來清除番茄體內氧自由基對番茄的損傷，具備溶解有機磷的能力，且TM1109 可溶解無機磷并具備良好的生物膜形成能力，有助于番茄對營養的吸收和生物膜對離子的選擇性吸收以抵抗鹽脅迫。表明TM1109、KY5104、TY4204 和KY4410 菌株可以通過多種作用機制來緩解番茄鹽脅迫并促進番茄生長。

6.2.3 防控病蟲害 根際促生菌內生孢子的高抗性結構不僅能忍受惡劣環境，還可以通過分泌脂肽、抗生素、酶等物質來抑制植物病原體的生長。枯草芽孢桿菌SL-44 能激活辣椒幼苗抗青枯病的系統抗性，還能產生表面活性素、伊枯草菌素和豐原素等抗菌肽，抑制甚至破壞立枯絲核病菌菌絲的生長（Im et al.，2020）。王其傳（2014）研究表明，接種1 ×10CFU·mLBBS 合劑的功能型生物活性基質，在西瓜、青花菜和辣椒等種苗培育過程中具有良好的促生和抗病效果，與常規育苗基質相比，促生效果分別達到63.13%、74.20%和35.27%，防病效果分別達到87.5%、83.1%和79.5%；在防治黃瓜根結線蟲方面，用微生物功能型基質（接種AR l56-2生防菌劑，含菌量為1 × 10CFU·mL）培育黃瓜幼苗，定植后對根結線蟲有明顯的抑制作用。

康貽軍等（2012）研究了RA2（）和WP8（）浸種和拌土處理對番茄青枯病的實際防治效果，以及對番茄根際微生物群落的影響。結果發現兩個菌株都具有防治番茄青枯病的作用，并能不同程度地促進番茄幼苗生長，主要體現在其能夠顯著提高番茄幼苗健株率，用RA2 和WP8 浸種處理后的健株率分別達68.9%和62.8%，而病原菌（對照）處理的健株率僅為22.4%；可以促進幼苗地上部增高、增粗和根部生長，如WP8 浸種處理的莖葉干質量和根干質量分別達到4.87 mg·株和35.69 mg·株，分別比對照提高l10.82%和205.83%。浸種處理的促進效應明顯優于拌土處理。