miR-212-5p通過靶向PCED1B基因抑制Wnt/β-catenin信號通路調控膀胱癌細胞的增殖和凋亡

王俊卿 王敏 李晶

(1酒泉市人民醫院，甘肅 酒泉 735000；2上海市口腔醫院)

膀胱癌(BC)是常見的泌尿系統惡性腫瘤，發病率和死亡率均居高不下，其主要治療方式是手術和輔助放化療，前期患者需要順鉑全身化療，或采用新的靶向或免疫治療〔1〕。研究表明，miRNA在癌癥中通常表達異常，可能與癌癥的分化、轉移和侵襲有關。miRNA在BC組織、患者尿液或血液樣本中表達異常，可能與患者診斷、預后、疾病監測和靶向治療等相關〔2〕。有報道顯示，miR-212-5p在胃癌〔3〕和三陰性乳腺癌〔4〕中低表達，其通過lncMIF-AS1/miR-212-5p/NDUFA4信號轉導促進胃癌細胞的增殖并抑制凋亡，其表達水平與乳腺癌的腫瘤大小、是否侵犯淋巴結和血管有關，其高表達可抑制乳腺癌的上皮間質轉化(EMT)及癌細胞的遷移和侵襲能力。本研究通過StarBase預測發現，miR-212-5p與PCED 1B可能存在靶向關系。PCED1B在膠質瘤中高表達，敲除PCED1B可以抑制膠質瘤細胞的增殖能力和誘導細胞凋亡能力〔5〕。但miR-212-5p和PCED1B在BC中表達和作用尚不清楚。根據生物信息學預測結果和上述報道結論，本研究以BC細胞系為主要研究對象，假設miR-212-5p靶向PCED1B基因通過Wnt/β-catenin信號通路調節BC細胞凋亡和增殖。

1 材料與方法

1.1材料 人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1及BC細胞系T24、RT4和UM-UC-3購自美國ATCC；RPMI1640培養基、F12K培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司；細胞培養板購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；引物、miR-212-5p模擬物(miR-212-5p)、miR-212-5p抑制劑(anti-miR-212-5p)、PCED1B抑制劑(si-PCED1B)、PCED1B高表達載體(pcDNA-PCED1B)和對照(miR-NC、anti-miR-NC、si-NC和pcDNA-NC)及PCED1B野生型和突變型雙熒光載體均購自上海吉瑪制藥有限公司；PCED1B抗體、細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、β-catenin抗體和β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、反轉錄(RT)-PCR試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將SV-HUC-1細胞培養在含10% FBS的F12K培養基中，將BC細胞T24、RT4和UM-UC-3培養在RPMI1640培養液中，培養液中均添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養條件：在濕度95%，37℃ 5%CO2培養箱中培養細胞，消化傳代。

1.2.2細胞轉染 將RT4細胞培養至對數生長期，收集細胞，胰蛋白酶消化，以1×106個細胞/ml接種于6孔板培養，當細胞融合度達到80%時根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。miR-NC、miR-212-5p mimics、si-NC、si-PCED1B分別轉染至RT4細胞，分別記為miR-NC組、miR-212-5p組、si-NC組、si-PCED1B組。miR-212-5p mimics和pcDNA-NC、miR-212-5p mimics和pcDNA-PCED1B分別共轉染至RT4細胞，分別記為miR-212-5p+pcDNA-NC組、miR-212-5p+pcDNA-PCED1B組。

1.2.3qRT-PCR檢測RNA的表達 總RNA提取試劑盒從SV-HUC-1、T24、RT4和UM-UC-3細胞中提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA并檢測，然后以cDNA 為模板，按照實時熒光定量PCR試劑盒的說明書進行反應，合成miR-212-5p和PCED1B mRNA。運用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.4CCK-8實驗測定細胞增殖率 胰蛋白酶消化轉染后的RT4細胞，培養基稀釋細胞，以濃度2×103個細胞/孔(200 μl細胞)接種于96孔板，加入20 μl CCK-8溶液，培養4 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。細胞增殖率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 將轉染后的RT4培養至對數生長期，用胰蛋白消化細胞，收集細胞，清洗細胞，稀釋細胞，取5×103個細胞，棄上清，加入195 μl AnnexinV-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5 μl AnnexinV-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，室溫避光孵育10～20 min，然后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6Western印跡 收集各組轉染的RT4細胞，室溫用放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解30 min，超聲破碎細胞，收集蛋白，檢測蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣本，轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，PCED1B抗體(1∶1 000)、CyclinD1抗體(1∶3 000)、酶切caspase-3抗體(1∶1 500)、β-catenin抗體(1∶6 000)和抗β-actin抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜。洗膜3次，然后加入稀釋的辣根過氧化物酶標二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內參，分析蛋白水平。

1.2.7雙熒光素酶報告系統實驗驗證miR-212-5p、PCED1B的靶向關系 根據1.2.2方法培養RT4至細胞融合度為80%，進行轉染，將構建的PCED1B的野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-212-5p共轉染RT4細胞，轉染48 h，收集細胞，裂解細胞，離心收集上清，-20℃保存或直接檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.8Western 印跡驗證miR-212-5p、PCED1B的調控關系 采用Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染，將miR-NC、miR-212-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-212-5p分別轉染至RT4細胞，轉染48 h后收集細胞，Western印跡檢測PCED1B蛋白表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1在BC細胞系中，PCED1B高表達，miR-212-5p低表達 與人膀胱上皮細胞SV-HUC-1組相比，BC細胞系T24、RT4和UM-UC-3組細胞中miR-212-5p含量均顯著下降(P<0.05)，PCED1B的mRNA和蛋白表達量均顯著上升(P<0.05)，見表1，圖1。PCED1B和miR-212-5p在T24、RT4和UM-UC-3 BC細胞系中表達情況一致，采用表達差異較大的RT4細胞進行后續實驗。

表1 BC細胞系中miR-212-5p和PCED1B 表達水平

圖1 Western印跡檢測PCED1B蛋白表達

2.2高表達miR-212-5p抑制BC RT4細胞增殖和促進細胞凋亡 與miR-NC組相比，miR-212-5p組RT4細胞中miR-212-5p含量顯著升高，CyclinD1和酶切caspase-3表達量均顯著降低，細胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著升高(均P<0.05)，見圖2，表2。說明高表達miR-212-5p可降低BC RT4細胞的增殖率，促進細胞凋亡。

A：流式細胞儀檢測細胞凋亡；B：Western印跡檢測CyclinD1、酶切caspase-3蛋白表達圖2 高表達miR-212-5p對BC細胞RT-4增殖和凋亡的影響

表2 高表達miR-212-5p抑制BC細胞RT4細胞增殖并促進凋亡

2.3低表達PCED1B對BC細胞RT4增殖和凋亡的影響 與si-NC組相比，si-PCED1B組RT4細胞中PCED1B、CyclinD1和酶切caspase-3、細胞增殖率均顯著下降(均P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖3、表3。說明低表達PCED1B可抑制BC RT4細胞增殖并促進凋亡。

A：流式細胞儀檢測細胞凋亡；B：Western印跡檢測PCED1B、CyclinD1、酶切caspase-3蛋白表達圖3 低表達PCED1B對BC細胞RT4增殖和凋亡的影響

表3 低表達PCED1B對BC細胞RT4增殖和凋亡的影響

2.4miR-212-5p靶向PCED1B StarBase預測發現，PCED1B的3′UTR中含有與miR-212-5p互補的位點，說明PCED1B可能是miR-212-5p的靶基因，見圖4。與miR-NC組相比，miR-212-5p組PCED1B WT的熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而PCED1B MUT的熒光素酶相對活性無顯著差異(P>0.05)。見表4。miR-212-5p組PCED1B蛋白水平(0.39±0.04)顯著低于miR-NC組(1.13±0.11，P<0.05)，anti-miR-212-5p組PCED1B蛋白水平(1.42±0.14)顯著高于anti-miR-NC組(1.16±0.12，P<0.05)。見圖5。說明miR-212-5p靶向負向調控PCED1B的表達。

2.5恢復PCED1B表達可部分反轉miR-212-5p高表達對RT4細胞凋亡和增殖的影響 恢復PCED1B表達后RT4細胞中的PCED1B、CyclinD1和酶切caspase-3表達量、細胞增殖率均顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6、圖7、表5。說明恢復PCED1B表達可部分逆轉miR-212-5p高表達對RT4細胞凋亡和增殖的影響。

圖4 StarBase對miR-212-5p和PCED1B結合 進行預測

表4 雙熒光素酶活性實驗

1～4：miR-NC組、miR-212-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-212-5p組圖5 Western印跡檢測PCED1B表達量

圖6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

圖7 Western印跡檢測PCED1B、CyclinD1、 酶切-caspase-3蛋白表達

表5 高表達PCED1B可部分逆轉miR-212-5p高表達對RT4細胞凋亡和增殖的影響

2.6Western印跡檢測Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達 與miR-NC組β-catenin蛋白水平(0.86±0.09)相比，miR-212-5p組(0.34±0.03)顯著降低(P<0.05)；與miR-212-5p+pcDNA-NC組β-catenin蛋白水平(0.36±0.04)相比，miR-212-5p+pcDNA-PCED1B組(0.72±0.07)顯著升高(P<0.05)；見圖8。說明過表達miR-212-5p可抑制Wnt/β-catenin信號通路，而恢復PCED1B表達可激活Wnt/β-catenin信號通路。

1～4：miR-NC組、miR-212-5p組、miR-212-5p+pcDNA-NC組、miR-212-5p+pcDNA-PCED1B組圖8 Western印跡檢測β-catenin蛋白表達

3 討 論

BC大多是淺表性的，大約有30%的BC會演變成肌肉浸潤性膀胱癌(MIBC)或轉移性BC，全身化療加放射治療是保留膀胱的重要治療方法，順鉑為主的化療是轉移性BC的主要治療手段，靶向抑制劑為主要形式的個性化治療也越來越多的用于BC，改善患者預后和延長生存期〔6〕。

研究表明，miR-212-5p與癌癥〔3，4〕、創傷性腦損傷〔7〕、帕金森病〔8〕、急性髓系白血病〔9〕等多種疾病有關。miR-212-5p在調節肝臟脂質代謝方面具有新的功能，可能是治療非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的潛在治療靶點〔10〕。miR-212-5p在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中表達下調，其可抑制COPD相關基因的過度表達，對COPD具有保護作用〔11〕。miR-212-5p在黑色素瘤組織中表達下調，其低水平與黑色素瘤細胞的增殖和侵襲有關，上調其表達可通過抑制kruppel樣因子(KLF)4蛋白進而抑制癌細胞的增殖和侵襲〔12〕。本研究結果發現，與人膀胱上皮細胞SV-HUC-1相比，miR-212-5p在BC細胞系T24、RT4和UM-UC-3中表達均顯著下調，與研究〔3，4，12〕結果類似；說明miR-212-5p在BC的發展中具有重要作用。

Yang等〔5〕發現PCED1B和PCED1B-AS1在膠質瘤中均表達升高，敲除PCED1B或PCED1B-AS1均可抑制膠質瘤細胞增殖并增強細胞凋亡能力，上調PCED1B可逆轉PCED1B-AS1沉默對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響，PCED1B通過PCED1B-AS1/miR-194-5p/PCED1B信號通路在膠質瘤中發揮致癌作用〔5〕。還有研究表明，PCED1B甲基化的升高可能與消防員癌癥風險增加有關〔13〕。本研究發現，PCED1B在BC細胞系A489、RT4和SN12-PM6中均表達上調，與研究〔5〕結論類似，低表達PCED1B可抑制BC RT4細胞增殖并促進凋亡。說明PCED1B在BC也發揮致癌作用。

Wnt/β-catenin信號通路在調控胚胎發育和維持成人體內干細胞平衡中起著關鍵作用，參與細胞等多種生理病理過程，Wnt/β-catenin通路失調與BC的發生、浸潤和轉移等過程密切相關〔14〕。Wnt參與了尿路上皮的發育和維持成人尿路上皮組織的穩態，Wnt/β-catenin通路關鍵分子的突變/表觀遺傳學改變與BC的發生、耐藥性的發展和生存率的提高有關〔15〕。

綜上，在BC RT4細胞中，miR-212-5p靶向PCED1B可能通過Wnt/β-catenin信號通路調控BC細胞凋亡和增殖。miR-212-5p可能是BC的潛在分子靶點。