桑天牛纖維素酶編碼基因的克隆及分泌表達

張 茂， 潘宇杰， 梁笑玲， 張楚玥， 陳少珍， 林曉玲， 李虹儀

(韶關(guān)學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院，廣東韶關(guān) 512005)

飼料原料的短缺問題一直影響著畜牧業(yè)的發(fā)展，成為我國畜牧業(yè)面臨的一大挑戰(zhàn)，因此需要不斷開發(fā)飼料資源。纖維素是自然界年產(chǎn)量巨大的可再生資源，然而這些寶貴的纖維素資源并沒有被有效地利用。此外，豬和家禽日糧中也存在大量纖維素因含有非淀粉多糖(non starch polysaccharides，NSP)等抗營養(yǎng)因子而降低了其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率而不能被畜禽利用。飼用酶制劑被認為是目前能有效解決養(yǎng)殖領(lǐng)域中飼料安全、飼料原料缺乏的新型飼料添加劑。為了促進不同類型飼糧纖維的合理開發(fā)和利用，可通過添加纖維素酶來提高動物機體對飼糧纖維的消化利用率，改善動物腸道健康，提高動物生產(chǎn)性能，以緩解飼料資源危機。纖維素酶來源有細菌、真菌、昆蟲等，同時也有大量不同來源的基因被克隆，如芽孢桿菌、木霉、青霉、牛瘤胃微生物、天牛、白蟻、白蟻體內(nèi)細菌、福壽螺等。動物源(如天牛、白蟻、福壽螺等)消化道分泌的纖維素酶對纖維素展現(xiàn)出較好的水解能力，其應用亦受到廣泛關(guān)注。桑天牛消化道內(nèi)源表達的纖維素酶在分解木質(zhì)纖維素方面具有較高的活性，可進一步將其研究應用于飼料資源的開發(fā)。本試驗以桑天牛為來源，克隆桑天牛腸道纖維素酶基因，構(gòu)建體外表達載體并在PK15細胞中進行表達，以期得到高活性的纖維素酶基因用于酶制劑生產(chǎn)或轉(zhuǎn)基因研究，拓寬畜牧業(yè)的飼料來源。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、LA酶、pMD18-T載體、連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性內(nèi)切酶(Ⅰ、Ⅰ)、DL 2000 DNA Marker、PCR檢測試劑Ex，均購自TaKaRa公司；膠回收Gel Extraction Kit D2500、質(zhì)粒提取Plasmid Mini Kit Ⅰ，均購自O(shè)mega公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofctamine、細胞培養(yǎng)試劑胎牛血清(FBS)、達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)，均購自Life公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、-葡聚糖，均購自Sigma公司。PK15細胞、表達載體pCMS-EGFP于筆者所在實驗室保存。試驗于2017年5月至2020年12月在華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院及韶關(guān)學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院進行。

1.2 引物設(shè)計

參考GenBank發(fā)布的桑天牛纖維素酶編碼基因(AY741064)、(AY451326)的序列，用DNAstar軟件進行引物設(shè)計，擴增其cDNA序列(長度分別為711、720 bp)，分別加入酶切位點Ⅰ、Ⅰ和Kozak序列，引物由深圳華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 纖維素酶基因擴增引物序列信息

1.3 RT-PCR擴增

將采集的桑天牛在超凈工作臺中的冰上分離出腸道組織，用TRIzol法提取腸道組織的總RNA，用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA的合成，反轉(zhuǎn)錄反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系：0.5 μL LA(5 U/μL)，5 μL 10×LABuffer Ⅱ，8 μL dNTP Mixture，各1 μL上、下游引物，4 μL模板，加ddHO至50 μL。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR產(chǎn)物分別與 pMD18-T 進行連接，然后進行轉(zhuǎn)化，再將單克隆菌液送至測序公司測序，將測序結(jié)果與參考序列進行比對分析，選擇無移碼、缺失、終止突變的克隆進行后續(xù)試驗。

1.4 酶切

分別以含有、基因的載體為模板進行PCR擴增，然后用限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ分別對表達載體pCMS-EGFP及PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，酶切體系：5 μL 10×QuickCut Green Buffer，各2.5 μL QuickCutⅠ、Ⅰ，30 μL DNA，加ddHO至50 μL。37 ℃保溫1 h，酶切結(jié)束后用Gel Extraction Kit進行目的片段的回收。

1.5 表達載體的構(gòu)建

將回收的載體片段pCMS-EGFP與插入基因DNA片段按照連接試劑盒(DNA Ligation Kit Ver.2.1)說明書比例混合制備成體積為10 μL 的DNA 溶液，加入等體積的10 μL Solution Ⅰ，充分混勻后于 16 ℃ 連接反應30 min，反應結(jié)束后將連接液進行轉(zhuǎn)化、涂板，挑單克隆菌落進行培養(yǎng)，用通用引物T3、T7進行菌液PCR，將PCR檢測陽性的菌液送往深圳華大基因科技有限公司測序，對測序結(jié)果進行比對，分析構(gòu)建質(zhì)粒的準確性。

1.6 轉(zhuǎn)染PK15細胞

將PK15細胞在含有5% FBS、1%雙抗的DMEM中于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用Plasmid Mini Kit Ⅰ試劑盒抽提表達質(zhì)粒DNA，用Lipofectamine 3000 進行轉(zhuǎn)染。將PK15細胞傳代于6孔板中，當細胞匯合度約為60%時進行轉(zhuǎn)染，分別用125 μL Opti-MEM將質(zhì)粒DNA(2.5 μg)和P3000Reagent(5 μL)進行稀釋，然后將稀釋的DNA加入到稀釋的轉(zhuǎn)染試劑中輕輕混勻，在室溫下孵育15 min，將孵育好的混合物加入培養(yǎng)細胞中混勻。將構(gòu)建的表達載體及空載體分別轉(zhuǎn)染3次，轉(zhuǎn)染后48 h在熒光顯微鏡下觀察增強綠色熒光蛋白(EGFP)的表達情況。

1.7 纖維素酶活性的測定

培養(yǎng)72 h后收集細胞培養(yǎng)液作為粗酶液，采用二硝基水楊酸法(DNS法)在溫度為40 ℃、pH值為4.5和5.5的條件下測定其水解活性。以1% CMC-Na 溶液作為底物，并參考NY/T 912—2004《飼料添加劑 纖維素酶活力的測定 分光光度法》測定纖維素酶活性；以0.8%-葡聚糖溶液作為底物，并參考NY/T 911—2004《飼料添加劑-葡聚糖酶活性的測定 分光光度法》測定-葡聚糖酶活性，計算出不同纖維素酶基因表達的粗酶液的纖維素酶活性、-葡聚糖酶活性。

1.8 纖維素酶基因的RT-PCR檢測

用細胞刮片將PK15細胞刮下，用TRIzol法提取培養(yǎng)細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用纖維素酶基因、擴增引物分別進行PCR擴增，檢測纖維素酶基因在PK15細胞中的表達情況。

1.9 統(tǒng)計分析

酶活性以“平均值±標準差”表示，對不同纖維素酶基因(、)表達的酶活性進行獨立樣本檢驗，用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Agc Ⅰ、Agc Ⅱ基因的擴增

以桑天牛腸道組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得大小約為730、740 bp的預期條帶(圖1)。測序結(jié)果與目的序列進行比對發(fā)現(xiàn)，克隆的基因(711 bp)有4個堿基發(fā)生突變，基因(720 bp)發(fā)生了8個堿基突變，相似度分別為99.4%(基因)和98.3%(基因)；基因編碼236個氨基酸，基因編碼239個氨基酸，氨基酸比對分析結(jié)果顯示，與目的基因氨基酸序列的相似度為100.0%，基因與目的基因氨基酸序列的相似度為99.6%，在第56位氨基酸位置上發(fā)生了S→N的突變，表明克隆的、基因沒有發(fā)生移碼、缺失、終止突變，可用于后續(xù)基因的表達試驗。

2.2 表達載體的構(gòu)建

通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測，構(gòu)建出包含纖維素酶基因的表達載體pCMS-、pCMS-(圖2)，測序結(jié)果正確，表明表達載體構(gòu)建成功。

2.3 轉(zhuǎn)染后EGFP的表達

利用脂質(zhì)體將表達載體pCMS-EGFP、pCMS-和pCMS-分別轉(zhuǎn)染PK15細胞，48 h后于熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果(圖3)顯示，轉(zhuǎn)染的PK15細胞中均觀察到EGFP的表達，視野中綠色熒光細胞數(shù)量較多，表明轉(zhuǎn)染效果良好。

2.4 纖維素酶活性的測定

利用DNS法在40 ℃測定纖維素酶基因表達粗酶液的活性。結(jié)果(圖4)顯示，以CMC-Na為底物，在pH值為5.5的環(huán)境下，、基因表達的纖維素酶活性分別為(0.09±0.01)、(0.24±0.02) U/mL；在pH值為4.5的環(huán)境下，纖維素酶活性分別為(0.07±0.00)、(0.20±0.01) U/mL。以-葡聚糖為底物時，在pH值為5.5的環(huán)境下，、基因表達的-葡聚糖酶活性分別為(0.27±0.02)、(0.43±0.05) U/mL；在pH值為4.5的環(huán)境下，-葡聚糖酶活性分別為(0.05±0.00)、(0.16±0.01) U/mL。空載體轉(zhuǎn)染的PK15細胞培養(yǎng)液中未檢測到纖維素酶、-葡聚糖酶。此外， 在以-葡聚糖、CMC-Na為底物及不同pH值條件下，基因表達的纖維素酶、-葡聚糖酶的活性都顯著高于基因(<0.05)。

2.5 纖維素酶基因的表達

通過提取轉(zhuǎn)染后PK15細胞總RNA進行RT-PCR檢測纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄表達，結(jié)果(圖5)顯示，在pCMS-、pCMS-轉(zhuǎn)染PK15細胞cDNA中擴增出、基因目的條帶，而在轉(zhuǎn)染空載體pCMS-EGFP的陰性對照PK15細胞中未檢測到有纖維素酶基因表達，表明纖維素酶基因在PK15細胞中表達成功。

3 討論

木質(zhì)纖維素是植物細胞壁的主要組成成分，是地球上最豐富的可再生生物質(zhì)，占據(jù)了地球90%以上光合作用產(chǎn)生的生物質(zhì)資源，同時也是一種飼料資源。在單胃動物日糧中添加纖維素酶可以有效消除飼料中纖維素的抗營養(yǎng)作用、提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，同時還能開發(fā)飼料資源。為了緩解畜牧業(yè)飼料資源短缺的局面，近幾年來，大量木本飼料如桑葉、辣木、構(gòu)樹等被開發(fā)用于豬和家禽飼料中，這些飼料中纖維素含量過高不易消化，更需要添加高活力的纖維素酶來降解含量較高的木質(zhì)纖維素，以更好地將這些非常規(guī)飼料用于畜禽養(yǎng)殖中。桑天牛主要以樹木纖維素為食源，它主要依靠腸道和唾液中的各種纖維素酶、半纖維素酶的協(xié)同作用分解食物中的纖維素、半纖維素，桑天牛自身能夠分泌纖維素酶并能有效分解木質(zhì)纖維素，因此本研究選擇從桑天牛腸道組織中克隆纖維素酶基因。本試驗成功從桑天牛腸道組織中克隆到了纖維素酶編碼基因、的cDNA序列，長度分別為711、720 bp，與目的基因序列相比，沒有發(fā)生移碼、缺失、終止突變，2個基因翻譯的氨基酸序列與目的基因序列相比相似度都在99%以上。此外，本研究克隆的纖維素酶基因的cDNA序列與基因的相似度為76%，同屬于GHF45家族，再次證明桑天牛自身消化道能夠分泌纖維素酶體系。

通過構(gòu)建表達載體分別轉(zhuǎn)染PK15細胞進行表達，在細胞培養(yǎng)液中檢測到了纖維素酶活力和-葡聚糖酶活性，表明克隆的纖維素酶基因兼具-葡聚糖酶活性。酶活性測定結(jié)果顯示，在40 ℃、pH值為4.5及pH值為5.5的條件下，纖維素酶基因表達的酶活性都優(yōu)于基因表達的酶活性，在pH值為5.5的條件下的酶活性優(yōu)于pH值為4.5的酶活性，所以基因可作為候選基因進行下一步研究。此外，對PK15細胞進行的RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)了纖維素酶基因、的表達，表明纖維素酶基因在PK15細胞中實現(xiàn)了分泌表達。

本研究克隆了桑天牛纖維素酶基因并構(gòu)建出真核表達載體，將其轉(zhuǎn)染PK15細胞進行了分泌表達，在基因表達的粗酶液中測定到了較高的纖維素酶及-葡聚糖酶活性，可以為桑天牛纖維素酶基因在轉(zhuǎn)基因及酶制劑制的生產(chǎn)方面提供參考。