某酸法地浸采鈾退役采區地下水微生物多樣性研究

王新廷，李 峰，王永東，張 輝，馬建洪，丁德馨*

(1.南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室； 2.南華大學極貧鈾資源綠色開發技術湖南省重點實驗室)

引 言

鈾是一種重要的戰略資源，也是核能發電所需要的重要基礎原料。天然鈾的持續穩定供給，對中國核能可持續發展具有重要意義[1-2]。因此，鈾礦資源的規模化開發將成為長遠戰略。

微生物原位修復技術應用的前提是掌握地下水中微生物群落結構和功能，從而為制定修復計劃提供數據支持。為此，本文采用高通量測序技術獲取了某酸法地浸采鈾退役采區地下水中微生物多樣性信息，并對該信息進行了深入分析，為該酸法地浸采鈾退役采區地下水微生物原位修復打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 地下水采集與分析

地下水樣采自某酸法地浸采鈾退役采區地面以下100 m處的含礦含水層。采用電感耦合等離子體質譜儀檢測鈾濃度，火焰原子吸收分光光度法檢測重金屬離子濃度，離子色譜法檢測陰離子濃度，精密 pH計檢測pH[12]。

1.2 地下水的高通量測序

由于地下水中含有較多的沉積物，因此在取樣前進行充分混合。取10 mL混合均勻的地下水樣品，采用Illumina MiseqTM/HiseqTM測序儀對地下水中微生物的16S rRNA和18S rRNA進行檢測。

1.3 樣本分析

將Illumina MiseqTM/HiseqTM測序儀得到的原始圖像數據文件經堿基識別(Base Calling)分析轉化為原始測序序列(Sequenced Reads)[13]。首先，根據overlap關系將二代測序得到的PE Reads進行拼接，區分樣本后對序列質量進行質控和過濾，然后進行OTU聚類(ASV去噪)分析和物種分類學分析[14]。基于OTU聚類(ASV去噪)分析結果，對OTU(ASV)進行多種多樣性指數分析，以及對測序深度進行檢測；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。在上述分析基礎上，對多樣本的微生物進行群落結構和功能分析。

2 結果與討論

2.1 地下水理化性質

2.2 微生物樣品測序

由于地下水的pH很低，所以在DNA提取過程中得到的初始DNA濃度低于0.05 ng/μL。在進行了2輪PCR擴增后，通過2 %瓊脂糖凝膠電泳進行文庫質控，獲得均勻的長簇效果和高質量的測序數據,然后使用Qubit 3.0熒光定量儀進行文庫濃度測定。

測序共獲得39 925條16S rRNA基因序列，有效基因序列32 985條，平均長度為458.29 bp，最短的為92 bp，最長的為504 bp;樣本聚類為246個OTUs。獲得的18S rRNA基因序列共35 510條，有效基因序列32 025條，平均長度為454.64 bp，最短的為44 bp，最長的為511 bp；樣本聚類為66個OTUs。

2.3 微生物物種豐富度及均勻度

根據樣本的各類信息構建地下水流動相中微生物多樣性的稀釋曲線(Rarefaction curve)，其可以反映樣本的取樣深度，結果如圖1、圖2所示(每條曲線代表一個樣本)。由圖1、圖2可知：2條曲線最后都趨于平緩，說明本次測序試驗的數據量足夠。

圖1 16S rRNA Alpha指數稀釋曲線

圖2 18S rRNA Alpha指數稀釋曲線

通過構建Rank Abundance曲線對2組樣品中的物種豐富度及均勻度進行分析，結果如圖3、圖4所示(每條曲線對應一個樣本)。由圖3、圖4可知：相對于18S rRNA而言，16S rRNA樣品的OTU Rank值范圍更大，說明16S rRNA樣品的物種組成更為豐富；曲線更平緩，說明物種分布更均勻。因此，在該酸法地浸采鈾退役采區中，細菌群落相較于真菌群落的物種組成豐富度更高，均勻性更好。

圖3 16S rRNA Rank Abundance曲線

圖4 18S rRNA Rank Abundance曲線

2.4 微生物多樣性分析

對地下水中微生物的多樣性指數進行評估，結果如表1所示。OTUs、Shannon指數、Chao指數、Ace指數與Simpson指數均用來評估微生物多樣性，OTUs越大，Shannon指數、Chao指數、Ace指數越大，Simpson指數越小，說明群落多樣性越高[15]。由表1可知：該地下水中細菌群落的多樣性明顯高于真菌群落的多樣性。

表1 樣品中微生物多樣性指數評估結果

地下水中微生物群落結構如表2、圖5和圖6所示。由表2、圖5和圖6可知：16S rRNA測序所得的優勢菌門種類有變形菌門(Proteobacteria，67.23 %)、擬桿菌門(Bacteroidetes，13.90 %)、厚壁菌門(Firmicutes，13.15 %)、放線菌門(Actinobacteria，1.52 %)、藍細菌門(Cyanobacteria，1.41 %)。18S rRNA 測序結果中發現的優勢菌門種類主要有子囊菌門(Ascomycota， 89.26 %)、鏈球菌門(Streptophyta，7.53 %)。

圖5 16S rRNA優勢物種相對豐度餅圖

圖6 18S rRNA優勢物種相對豐度餅圖

2.5 FAPROTAX分析

FAPROTAX分析結果如表3所示。由表3可知：樣本中的微生物類型主要為甲基營養型、甲烷營養型、硫酸鹽呼吸型、甲醇營養型。研究結果為后續微生物原位修復地下水時，添加到環境中碳源的選擇提供理論數據支持。

表3 FAPROTAX數據庫預測的菌群功能ID

3 結 論

1)高通量測序結果表明，該酸法地浸采鈾退役采區地下水中微生物既有細菌，也有真菌，且細菌群落的多樣性明顯高于真菌群落的多樣性。

2)該酸法地浸采鈾退役采區地下水中的細菌以變形菌門為主，占比達67.23 %，而真菌以子囊菌門為主，占比達89.26 %。

3)該酸法地浸采鈾退役采區地下水中的微生物類型主要為甲基營養型、甲烷營養型、硫酸鹽呼吸型、甲醇營養型。