足月子癇前期孕婦胎盤組織中DLX3基因啟動子甲基化狀態及其差異表達

孫修麗 牛三強 徐振宇 譚憲巖 于康軍

子癇前期是一種嚴重的人類妊娠多系統疾病，其特點是妊娠期高血壓和蛋白尿，甚至出現腎功能衰竭、肝功能不全和神經系統表現等[1-2]。盡管子癇前期是導致孕產婦死亡的主要原因之一，但其病因在很大程度上是未知的。先前的研究[3]表明，子癇前期的發病機制與遺傳和表觀遺傳因素有關。后者包括許多方面，例如組蛋白修飾和DNA甲基化[4]。與遺傳因素不同，DNA甲基化是可逆的，這為治療提供可能。遠端缺失同源盒3(homeobox gene distal-less3,DLX3)基因是同源異型盒基因家族中的一員，在調控胚胎生長發育方面起到重要作用[5]。據報道[6]，DLX3基因在子癇前期胎盤組織中低表達，其低表達的原因尚不明確。為此，本研究分析足月孕婦胎盤組織中DLX3啟動子甲基化狀態對基因表達和子癇前期嚴重程度的影響，旨在為子癇前期治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年1月在亳州市人民醫院足月分娩的子癇前期孕婦50例作為觀察組(其中重度子癇前期20例)。子癇前期的診斷標準參照2020年中國妊娠期高血壓疾病診治指南[7]。觀察組納入標準：①均為單胎足月妊娠；②不伴有其他妊娠合并癥；③不伴有精神異常和智力障礙。排除標準：①孕前患有原發性高血壓、慢性腎病、心臟病的孕婦；②孕前吸煙，飲酒和長期吸毒；③輔助生殖妊娠。對照組為同期足月分娩無原發性高血壓及其他并發癥的孕婦36例。本研究取得亳州市人民醫院倫理委員會的批準(倫理編號：2022014)，且均簽署知情同意書。兩組孕婦既往妊娠次數、孕前身體質量指數(body mass index， BMI)、年齡，以及分娩胎齡、新生兒性別、出生體質量以及5分鐘 Apgar評分比較，差異均無統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 觀察組和對照組的臨床數據比較

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 基因組DNA試劑盒(貨號：DP331，北京天根生物)，CpG甲基轉移酶(貨號：CB25768516，上海澤葉生物)，EZ DNA甲基化試劑盒(貨號：D5005，北京天漠科技)，Trizol試劑(型號：PH1420，日本TaKaRa)，SYBR Green PCR試劑盒(貨號：208057，北京諾博萊德科技)，ABI Veriti96 PCR擴增儀 (美國ABI公司)，甲基化引物及PCR引物合成均由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2.2 樣品采集 取出胎盤后，30 min內從胎盤的離母體面5 mm的深度收集胎盤絨毛組織樣本(0.5 cm×0.5 cm)。這些樣品在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌除去母體血液，并在-80℃環境下保存備用。

1.2.3 DNA分離和甲基化特異性PCR(methylmion specific PCR,MSP) 根據制造商的說明，使用基因組DNA試劑盒從裂解的胎盤絨毛樣品中分離基因組DNA。用CpG甲基轉移酶處理的人胎盤基因組DNA作為甲基化陽性對照，非甲基化陽性對照購自北京艾德科技公司的A&D fastTM人非甲基化標準品。使用EZ DNA甲基化試劑盒，將基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理。對處理后的DNA進行MSP，反應條件： 98℃變性15 s，退火15 s，72℃延伸45 s，35個循環，最后在72℃下延伸3 min，MSP產物參考文獻[8]行凝膠電泳進行甲基化判讀。DLX3上下游甲基化引物(退火60℃)：5’-GTAATGGTGTAAGCGTTTTTCG-3’和5’-ACCACTCATCCTAA CGAACG-3’； DLX3非甲基化上下游引物序列(退火61℃)：5’-GGTAATGGTGTAAGTGTTTTTTGG-3’和5’-AACCACTCATCCTA ACAAA CACT-3’。

1.2.4 RNA提取和實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(real time quantitative PCR,RT-qPCR) 按照說明書，使用Trizol試劑從胎盤中分離總RNA，然后用不含RNase的DNase I處理，最后評估RNA的濃度和純度后，通過反轉錄產生cDNA。通過SYBR Green PCR試劑盒檢測DLX3的表達。使用2-ΔΔCt方法評估DLX3基因的相對mRNA表達水平，并以內參對照β-action進行標準化。擴增條件：95℃ 5 min，98℃ 10 s，退火30 s，72℃ 45 s，38個循環，最后在72℃延伸10 min，實驗進行3次。DLX3基因的上下游引物(退火55℃)：5’-TACACCTACCACCACCAAT-3’和5’-CTCCTTCA CCGACACTG-3’； β-action內參基因上下游序列(退火57℃)：5’-AACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’和5’-GATCCACATCTGCTGGAAGG -3’。

2 結果

2.1 足月子癇前期孕婦胎盤中DLX3基因啟動子甲基化情況 與對照組的胎盤中DLX3基因啟動子的甲基化率相比(8/36，22.22%)，足月子癇前期孕婦的胎盤中其甲基化率升高(38/50，76.00%)，差異具有統計學意義(χ2=24.331，P<0.001)。 見圖1。

2.2 DLX3基因mRNA表達情況 RT-qPCR結果顯示，對照組胎盤中DLX3基因mRNA高表達(0.98±0.17)，而足月子癇前期孕婦胎盤組織中DLX3基因mRNA表達下降(0.41±0.08)，差異具有統計學意義(t=17.761，P<0.001)。重度子癇前期較輕度子癇前期孕婦胎盤組織中DLX3基因mRNA表達降低[(0.38±0.08)比(0.43±0.08)]，差異具有統計學意義(t=2.547，P=0.014)。

2.3 DLX3基因啟動子區甲基化率與子癇前期嚴重程度的比較 輕度子癇前期孕婦胎盤中DLX3基因啟動子區甲基化率為63.33%(19/30)，重度子癇為95.00%(19/20)，差異具有統計學意義(χ2=4.975，P=0.026)。

3 討論

子癇前期的病理生理基礎是由于胎盤滋養細胞侵襲性缺陷以及胎盤螺旋動脈異常重塑，導致胎盤異常表達的轉錄因子釋放到母體血液循環中，從而誘發母體疾病[9]。基于子癇前期的臨床癥狀在胎盤娩出后迅速消失，胎盤因素在子癇前期發病機制中的作用一直是研究的熱點。已有研究[10]通過比較子癇前期和正常孕婦胎盤中基因表達的改變，發現基因甲基化在子癇前期發展中起到一定作用。但是基因組甲基化的變化受各種因素影響。Yuen等[11 ]研究表明，早發型和晚發型子癇前期之間甲基化譜不同，但他們沒有討論胎齡對甲基化水平的影響。因此，本研究通過分析足月子癇前期和足月正常分娩孕婦胎盤組織中基因甲基化情況來消除胎齡的影響，探討甲基化對基因表達和疾病嚴重程度的影響。

DLX3基因是一類重要的轉錄因子，是正常胎盤形成所必需的[5]。胎盤中DLX3通過調節基質金屬蛋白酶 9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)的表達，導致母體胎盤螺旋動脈重鑄不足[12]。MMP-9基因在小鼠模型中的表達缺失導致妊娠晚期的母體出現高血壓，類似于子癇前期[13]。Li等[14]研究表明，DLX3可能通過調節胎盤生長因子(placental growth factor,PGF)的異常表達導致子癇前期。與趙先蘭等[6]的研究一致，本研究顯示，與正常足月妊娠相比，足月子癇前期孕婦胎盤中DLX3基因mRNA表達水平降低，提示胎盤中DLX3基因的下調可能導致了子癇前期的發生。考慮DLX3基因的表達降低可能影響胎盤螺旋動脈及血管床的重鑄，進而導致胎盤缺血、缺氧，是子癇前期發病機制之一。

妊娠期胎盤滋養層細胞的異常分化和增殖常涉及胎盤組織表觀遺傳學狀態的變化，其主要通過改變基因組DNA對轉錄因子的抑制或促進，從而影響基因活性[15]。本研究結果表明，與正常足月妊娠的胎盤中DLX3基因啟動子的甲基化率相比，足月子癇前期孕婦的胎盤中甲基化率明顯升高，推測子癇前期孕婦胎盤中DLX3基因啟動子的異常高甲基化狀態可能導致DLX3基因表達受到抑制。Yeung等[16]的研究顯示，子癇前期胎盤的WNT2 基因啟動子區中DNA 甲基化率增加，在重度子癇前期中甲基化率增加更明顯，且在重度子癇前期孕婦胎盤中 WNT2 表達降低。本研究與其相似，重度子癇前期孕婦胎盤組織中DLX3啟動子區甲基化率較輕度子癇前期高，與DLX3 mRNA的表達相反，提示DLX3基因表達受甲基化的影響，為臨床治療提供了思路。

綜上所述，足月子癇前期孕婦胎盤中DLX3啟動子甲基化率升高，且重度子癇前期甲基化率更高。DLX3啟動子甲基化可能抑制了DLX3的表達，進一步影響子癇前期的嚴重程度。但本研究未對非足月子癇前期胎盤組織中DLX3基因啟動子區的甲基化情況進行檢測，后續有待改進。