雙波長HPLC法同時測定夏枯草中8種成分的含量

孫夢秋，佘勝楠，周麗紅，成家禧，馮春來

(江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013)

夏枯草藥材為唇形科植物夏枯草(PrunellavulgarisL.)的干燥果穗，其性寒，味辛、苦，歸肝、膽經，具有清肝瀉火，散結消腫等功效[1]。現代研究表明，夏枯草中主要含有萜類、酚酸類、黃酮類、香豆素類等多種活性成分[2-3]，具有降血壓、降血糖、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[4-5]。2020年版中國藥典中以迷迭香酸為夏枯草中成分含量控制的指標，而對其他活性成分的含量控制未有明確規定。目前，已有研究分別對夏枯草中主要的三萜類成分、酚酸類及黃酮類成分等進行了含量測定[6-7]。方羅等[8]建立高效液相色譜法(HPLC)同時測定夏枯草中熊果酸、齊墩果酸、咖啡酸、迷迭香酸4種活性成分的含量。黃茲英等[9]建立HPLC法對夏枯草中主要黃酮類成分蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚的含量進行同時測定。皮勝玲等[10]采用超高效液相色譜法對不同生長期夏枯草中差異較大的3種酚酸類成分進行含量檢測。但未見有文獻報道使用HPLC同時測定夏枯草中咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素。本實驗采用雙波長HPLC法測定夏枯草中8種活性成分，能夠高效簡便地對夏枯草中多種成分的含量同時進行檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；BSA124S型電子天平(德國Sartorius公司)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。東莨菪內酯對照品購自上海源葉生物科技有限公司，咖啡酸、對香豆酸、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素購自上海麥克林生化科技有限公司，質量分數 ≥ 98%；夏枯草藥材購自河南(批號：20210116、20210822)、湖北(批號：20210906)、江蘇(批號：20210926)、四川(批號：20220111)、安徽(批號：20220103)等不同產地，經江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為唇形科植物夏枯草的干燥果穗；乙腈和乙酸(色譜純)購自國藥集團，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品各5 mg，以甲醇溶解并稀釋至5 mL，制成質量濃度均為1 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成8個成分濃度均為100 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取夏枯草藥材適量，粉碎，精密稱取1 g夏枯草粉末，置具塞錐形瓶中，按照料液比為1 ∶10加入50%乙醇10 mL，稱重，40 ℃超聲(功率250 W，頻率40 kHz)提取40 min，放冷至室溫，再稱重，用50%乙醇補充失重，搖勻，3 700 r/min離心10 min后取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為InertSustainTMODS-C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫體系為0～30 min，10%～25% A；30～50 min，25%～45% A；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為325 nm(咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸)和360 nm(秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素)。

1.2.4 線性關系考察 精密吸取“1.2.1”項下混合對照品溶液適量，用甲醇依次稀釋成8種成分濃度均為1、5、10、50、100 μg/mL的混合對照品溶液。按照“1.2.3”項下色譜條件依次進樣測定，記錄峰面積。

1.2.5 精密度試驗 精密吸取低(5 μg/mL)、中(50 μg/mL)、高(100 μg/mL)三個濃度的混合對照品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件每個濃度重復進樣3次，記錄峰面積，計算相對標準偏差(RSD)值。

1.2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號：20210116)，室溫下于0、4、8、12 h按“1.2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算RSD值。

1.2.7 重復性試驗 取同一夏枯草粉末(批號：20210116)6份，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算RSD值。

1.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一夏枯草粉末(批號：20210116)6份，每份1.0 g，分別精密加入8個對照品適量(與1.0 g樣品中各待測成分的量相當)，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算平均加樣回收率及其RSD值。

1.2.9 樣品含量測定 取不同產地夏枯草藥材，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積。

2 結果

2.1 色譜條件考察

按照“1.2.3”項下的色譜條件進樣，混合對照品溶液及夏枯草供試品溶液的色譜圖見圖1。8種成分與其相鄰色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數以各色譜峰計算均不低于5 000。

A： 混合對照品溶液(325 nm)；B： 夏枯草供試品溶液(325 nm)；C： 混合對照品溶液(360 nm)；D： 夏枯草樣品溶液(360 nm)。1.秦皮乙素；2.咖啡酸；3.對香豆酸；4.東莨菪內酯；5.蘆丁；6.金絲桃苷；7.迷迭香酸；8.槲皮素

2.2 線性關系考察

以對照品的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數。結果表明8種成分在1～100 μg/mL濃度范圍內與各自峰面積的線性關系良好(表1)。

表1 8種成分的線性關系考察結果

2.3 精密度考察

計算得到咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素在5 μg/mL濃度下的RSD分別為1.53%、1.49%、1.77%、1.69%、1.53%、1.76%、1.43%、1.67%；在50 μg/mL濃度下的RSD分別為1.48%、1.17%、1.17%、0.89%、1.75%、1.12%、1.36%、1.89%；在100 μg/mL濃度下的RSD分別為0.91%、1.78%、1.42%、1.24%、1.33%、0.71%、1.30%、1.55%。該8種成分在三個濃度下的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩定性考察

計算得到咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的RSD分別為0.84%、0.96%、1.16%、0.25%、2.01%、1.99%、1.38%、2.22%，8個成分的RSD均小于3%，表明供試品溶液室溫下放置12 h內穩定。

2.5 重復性考察

計算得到咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的RSD分別為1.91%、1.49%、2.19%、0.42%、2.62%、2.65%、1.20%、2.71%，8種成分的RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.6 加樣回收率考察

計算得到咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的平均加樣回收率分別為101.93%、99.20%、100.65%、98.63%、99.45%、101.39%、99.13%、102.36%；RSD分別為2.24%、2.50%、1.78%、1.64%、1.83%、2.08%、2.11%、1.57%。8個成分的平均加樣回收率為98.63%～102.36%，RSD均小于3%，表明本方法準確性良好。

2.7 樣品含量測定結果

分別計算不同產地夏枯草中8種成分的含量，結果見表2。實驗結果表明，安徽產地的夏枯草中迷迭香酸、蘆丁和金絲桃苷含量均較高，分別為5.240 mg/g、0.368 mg/g和0.195 mg/g；河南產地的夏枯草(批號：20210116)中咖啡酸、對香豆酸和槲皮素含量較高，分別為0.459 mg/g、0.023 mg/g、0.027 mg/g；江蘇產地的夏枯草中東莨菪內酯含量最高，為0.098 mg/g；四川產地的夏枯草中秦皮乙素含量最高，為0.041 mg/g。

表2 不同產地與批號的夏枯草中8種成分的含量測定結果 mg/g

3 討論

本實驗在200～400 nm波長范圍內對夏枯草中8種成分進行了紫外全波長掃描，其中在325 nm波長下咖啡酸、迷迭香酸有最大吸收，在360 nm波長下蘆丁、金絲桃苷有最大吸收，其余4種成分在兩個波長下均有吸收。其中秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷和槲皮素在360 nm下具有更好的線性關系，且在該波長下供試品中其他成分對該8種成分的干擾較小，基線更平穩，但對香豆酸在此波長下響應值較低；而在325 nm下對香豆酸、咖啡酸、迷迭香酸和東莨菪內酯吸收更強且線性關系更好。故選擇325 nm和360 nm雙波長同時測定該8種成分。

實驗中曾采用水-甲醇、0.1%乙酸水-甲醇、水-乙腈、0.1%乙酸水-乙腈作為流動相，并分別考察了等度洗脫和不同梯度洗脫的方法，結果表明在梯度洗脫條件下，以0.1%乙酸水-乙腈作為流動相時，各成分的色譜峰分離效果較為理想，峰形均較好且無拖尾現象。

在預實驗中分別考察了水、不同比例的甲醇和乙醇作為提取溶劑對夏枯草中8種成分提取含量的影響。經綜合比較發現，50%的乙醇作為提取溶劑時效果最佳，該8種成分均可檢測出，且其中咖啡酸、蘆丁、迷迭香酸含量均較高。此外，研究結果表明，購自5個產地的夏枯草藥材中均含有咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素，但不同產地的夏枯草中該8種成分的含量存在較大差異，可能與其生長環境不同以及采收季節的不同有關。

本研究建立了一種雙波長條件下同時測定夏枯草中咖啡酸、對香豆酸、東莨菪內酯、迷迭香酸、秦皮乙素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素8種成分的HPLC法。所建立的方法簡單高效，準確可靠，重復性良好，為夏枯草的質量控制提供了有益參考。