小鼠深靜脈血栓實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?/h1>
2022-08-25 07:36:04張茜谷田劉哲宇李思鄭曉新
張茜， 谷田， 劉哲宇， 李思， 鄭曉新
(1. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430060； 2. 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060； 3. 武漢大學(xué)心血管病研究所，湖北 武漢 430060)
深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)是多種因素引起的靜脈血栓性疾病，多發(fā)生在腿部，并伴有肺栓塞，統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞[1]。DVT成因復(fù)雜，主要有遺傳因素、創(chuàng)傷、血液黏度增大、長(zhǎng)期固定、血管內(nèi)皮功能異常等[2]。患病后易造成肢體殘疾，甚至危及生命，其治療主要包括抗凝[3]和介入治療[4]等。然而DVT病變過程復(fù)雜，病因尚未完全明確，研究DVT形成的信號(hào)傳導(dǎo)通路、標(biāo)志性的早期預(yù)警因子、預(yù)防和治療的藥物研發(fā)都離不開動(dòng)物模型。小鼠因具有價(jià)廉、操作方便、可重復(fù)性強(qiáng)、符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則[5]等特點(diǎn)而成為DVT研究的首選動(dòng)物。小鼠DVT模型制備的質(zhì)量及成功率將直接影響實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)度和可信度，目前系統(tǒng)討論小鼠DVT模型制備方法的報(bào)道較少。本研究旨在構(gòu)建一種操作性、可行性和實(shí)用性強(qiáng)的小鼠DVT模型，探討相關(guān)構(gòu)建的方法。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
C57BL/6J小鼠56只， 6～8周齡，雌雄不限，體重20～25 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)操作遵守武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=6)、假手術(shù)組(n=12)、手術(shù)1組(n=12)、手術(shù)2組(n=12)、內(nèi)毒素+手術(shù)組(n=14)。正常對(duì)照組不做處理；手術(shù)1組行下腔靜脈90%結(jié)扎術(shù)；假手術(shù)組除不結(jié)扎外，其他操作同手術(shù)1組；手術(shù)2組在結(jié)扎術(shù)前2 h，腹腔注射0.1 mL的生理鹽水；內(nèi)毒素+手術(shù)組在結(jié)扎術(shù)前2 h，腹腔注射溶于0.1 mL生理鹽水的0.1 mg/kg內(nèi)毒素(脂多糖，美國(guó)Sigma公司)。
1.2 DVT模型制備
1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備及超聲評(píng)估 實(shí)驗(yàn)小鼠術(shù)前4 h禁水，12 h禁食，稱重，用2%異氟醚-氧(氧濃度100%)混合物麻醉小鼠，待小鼠安靜、呼吸平穩(wěn)后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)。使用Visual Sonics帶有40 MHz小鼠掃描頭的Vevo 2100 系統(tǒng)獲得下腔靜脈和周圍結(jié)構(gòu)、血管以及血流的圖像。
1.2.2 分離下腔靜脈 腹部消毒，沿其腹白線切開，切口不要太長(zhǎng)，下至凝固腺，上至露出肝臟一角即可。用濕棉簽小心撥出小腸等器官置于小鼠左側(cè)，用溫生理鹽水浸濕的紗布包裹，顯露下腔靜脈。在解剖顯微鏡下辨別下腔靜脈和腹主動(dòng)脈以及旁邊的輸尿管和神經(jīng)，用顯微器械小心地在腎動(dòng)脈分叉水平以下節(jié)段，將下腔靜脈與主動(dòng)脈分離，結(jié)扎所有下腔靜脈側(cè)支。
1.2.3 下腔靜脈結(jié)扎及術(shù)后即刻超聲評(píng)估 參考Ponomaryov等[6]方法，將1根30 G的針頭與下腔靜脈用7-0聚丙烯縫線一并綁繞，再移除針頭，該方法可使下腔靜脈面積縮小約90%，且不損傷血管內(nèi)皮。腹腔中加入8 000 U青霉素預(yù)防傷口感染，用5-0縫合線逐層縫合腹腔。迅速在下腔靜脈所在區(qū)域覆蓋超聲凝膠，使用Vevo 2100超聲影像系統(tǒng)獲得下腔靜脈和周圍結(jié)構(gòu)、血管以及血流的圖像。隨后紗布清潔和碘伏消毒。
1.2.4 術(shù)后護(hù)理 將小鼠置于25～28 ℃的環(huán)境中，直至復(fù)蘇。保持墊料清潔干燥，常規(guī)飼養(yǎng)及飲水，監(jiān)測(cè)小鼠精神狀態(tài)、食欲、傷口恢復(fù)和體重情況。術(shù)后肌注青霉素8 000萬/d預(yù)防傷口感染。
1.3 標(biāo)本的獲取及測(cè)量
造模術(shù)后48 h，用90 mg/kg、5%戊巴比妥鈉腹腔注射小鼠，致過量麻醉后處死小鼠。沿腹白線開腹，移開小腸等器官，顯露下腔靜脈。在下腔靜脈的結(jié)扎處下方，取出結(jié)扎線遠(yuǎn)心端長(zhǎng)度為1.0 cm的下腔靜脈段血管，小心分離血栓，進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，超聲測(cè)得的血栓面積和按比例確定的血栓重量顯示出很強(qiáng)的相關(guān)性(r2=0.96)。因此，本研究中使用的手動(dòng)血栓大小評(píng)估方法可以被認(rèn)為是有效的，與傳統(tǒng)的超聲測(cè)量面積的方法相比，更加簡(jiǎn)單便捷。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
2.1 手術(shù)成功率及死亡率
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后死亡視為手術(shù)失敗。正常對(duì)照組的6只小鼠全部存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)；假手術(shù)組小鼠手術(shù)成功率為66.7%(8/12，不合格2只)，術(shù)后死亡率為16.7%(2/12，1只為麻醉意外，1只為出血)；手術(shù)1組小鼠手術(shù)成功率為66.7%(8/12)，術(shù)后死亡率為25.0%(3/12，1只為麻醉意外，1只為出血，1只為感染)；手術(shù)2組小鼠手術(shù)成功率為75.0%(9/12)，術(shù)后死亡率為25.0%(3/12，2只為出血，1只為感染)；內(nèi)毒素+手術(shù)組手術(shù)成功率為50.0% (7/14，不合格1只)，術(shù)后死亡率為42.8%(6/14，2只為出血，4只為感染)。內(nèi)毒素+手術(shù)組有4例動(dòng)物在注射內(nèi)毒素后死亡，不能排除由內(nèi)毒素引起，故在計(jì)算下腔靜脈狹窄術(shù)手術(shù)總死亡率和成功率時(shí)，僅納入手術(shù)1組和手術(shù)2組數(shù)據(jù)。下腔靜脈狹窄手術(shù)的小鼠共24只，下腔靜脈狹窄術(shù)總死亡率為25.0%(6/24)，總成功率為70.8%(17/24)。死亡原因主要為麻醉意外、術(shù)中或術(shù)后出血、傷口感染。在觀察終點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組存活動(dòng)物體重?zé)o明顯差異。
2.2 麻醉效果
用異氟醚在自制麻醉盒里誘導(dǎo)麻醉30～40 s，隨后以2%異氟醚-氧混合物持續(xù)麻醉小鼠，維持效果好，以動(dòng)物安靜、捏腳趾反射消失和呼吸平穩(wěn)為完全麻醉表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)麻醉意外死亡2只，均為瘦弱個(gè)體，推測(cè)可能也與異氟醚誘導(dǎo)麻醉時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)(>50 s)。
2.3 手術(shù)成功評(píng)價(jià)
圖1顯示的是小鼠DVT模型構(gòu)建過程，白光及血管超聲圖片。在小鼠的下腔靜脈未結(jié)扎前，超聲顯示血流清晰且通暢，下腔靜脈易于壓縮。在下腔靜脈結(jié)扎并拔掉30 G針頭后即刻，超聲可見結(jié)扎線遠(yuǎn)端一束來自后側(cè)支的靜脈血流注入下腔靜脈的信號(hào)，說明仍有靜脈血流通過結(jié)扎點(diǎn)，表明血栓模型造模成功。
2.4術(shù)后動(dòng)物基本情況和取材前大體觀
所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物術(shù)后2～3 h逐漸開始活動(dòng)，24 h后活動(dòng)量明顯增大，內(nèi)毒素+手術(shù)組小鼠活動(dòng)稍差、精神欠佳、食欲減退。正常對(duì)照組和假手術(shù)組下腔靜脈管徑粗細(xì)均勻，管壁薄而柔軟，內(nèi)膜面平整、光滑。手術(shù)1組、手術(shù)2組和內(nèi)毒素+手術(shù)組小鼠術(shù)后48 h形成DVT的下腔靜脈血管段血管彈性下降，腹腔內(nèi)均可見腸系膜靜脈血管明顯擴(kuò)張，腸蠕動(dòng)減弱，并可見輕-中度腸脹氣。
A：下腔靜脈結(jié)扎時(shí)，箭頭所示為30G針頭；B：下腔靜脈 90%結(jié)扎后即刻；C：結(jié)扎前下腔靜脈超聲圖，箭頭所示為下腔靜脈血流信號(hào)；D：下腔靜脈結(jié)扎后超聲圖，箭頭所示為后側(cè)支靜脈血流信號(hào)
2.5 血栓重量與長(zhǎng)度
各組血栓形成情況如圖2所示。以同一批次小鼠形成血栓的重量和長(zhǎng)度是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，來評(píng)估DVT模型的穩(wěn)定性。手術(shù)1組與手術(shù)2組的下腔靜脈血栓重量和長(zhǎng)度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[重量：(5.58±3.98) mgvs.(5.80±4.33)mg，t=-0.105，P=0.918；長(zhǎng)度：(3.30±1.92) mmvs.(3.51±2.45)mm,t=-0.196，P=0.847]。與手術(shù)2組相比，內(nèi)毒素+手術(shù)組血栓長(zhǎng)度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(6.37±2.08)mmvs.(3.51±2.45)mm，t=2.469，P=0.027]，血栓重量也增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(9.81±4.72)mgvs.(5.80±4.33)mg，t=1.771，P=0.098]。正常對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1組、手術(shù)2組和內(nèi)毒素+手術(shù)組形成血栓例數(shù)占比依次為0、0、87.5%、77.7%和100%。
圖2 各實(shí)驗(yàn)組血栓形成情況
3 討論
DVT是血液在深靜脈內(nèi)不正常凝結(jié)引起的靜脈回流障礙性疾病。深入研究其致病機(jī)理，對(duì)改善患者癥狀、降低并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率有重要意義。而建立穩(wěn)定可靠且符合臨床DVT特點(diǎn)的動(dòng)物模型是這一問題的研究基礎(chǔ)。
既往研究嘗試多種不同的動(dòng)物制備模型[8]。楊軍等[9]認(rèn)為，在血栓機(jī)化的早期階段，不同動(dòng)物個(gè)體間存在著相似的規(guī)律。目前小鼠應(yīng)用最為廣泛，其優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在[10]：① 標(biāo)準(zhǔn)“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物”可受到全面控制，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性；② 技術(shù)操作的可行性高；③成本低，易于取得。
眾多危險(xiǎn)因素均是通過Virchow提出的血栓形成3大要素，即血管壁損傷、血流緩慢、血液高凝狀態(tài)而促進(jìn)靜脈血栓的形成[11]。目前常采用的方法有[12]：① 下腔靜脈狹窄法，通過外力加壓下腔靜脈導(dǎo)致穩(wěn)定的層狀血栓形成。該法保證近心端通暢，更符合人體血栓形成特點(diǎn)，形成血栓時(shí)間較長(zhǎng)，量少且數(shù)值相差不大。適合血栓溶解和再通的實(shí)驗(yàn)研究。② 下腔靜脈結(jié)扎法，通過手術(shù)閉塞下腔靜脈，從而損傷血管，暴露血管內(nèi)皮下膠原纖維，并造成局部低氧環(huán)境和炎癥反應(yīng)，最終激活凝血系統(tǒng)[13]。該法不能保障血栓的近心端通暢，不適合藥物研究。③ 電解損傷法，即將直流電通過導(dǎo)線誘導(dǎo)血管內(nèi)自由基形成，從而使內(nèi)皮細(xì)胞活化，誘發(fā)形成血栓。該模型可用于血栓治療藥物研發(fā)，但手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)，并可使靜脈壁完整性破壞。本研究使用了上述第一種方法，即下腔靜脈狹窄法。在該模型中，下腔靜脈管腔體積減小了約 90%。血栓形成由內(nèi)皮細(xì)胞活化啟動(dòng)，形成于血流速度降低的狹窄點(diǎn)遠(yuǎn)心端。在組織學(xué)上觀察到該模型中形成的血栓也與人類靜脈血栓相似[14]。因此基于該模型所獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有一定的參考價(jià)值。
本實(shí)驗(yàn)總結(jié)提高成功率降低死亡率的要點(diǎn)如下，① 動(dòng)物質(zhì)量、飼養(yǎng)環(huán)境及術(shù)前護(hù)理：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。術(shù)前12 h禁食、4 h禁水，避免過多消化道內(nèi)容物影響手術(shù)過程，降低術(shù)后發(fā)生腸梗阻等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。② 麻醉效果：本實(shí)驗(yàn)麻醉意外死亡2只，推測(cè)可能與自身體弱及異氟醚誘導(dǎo)麻醉時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)。小鼠體型小，應(yīng)注意避免麻醉藥物過量。③ 預(yù)防出血和組織損傷：切口應(yīng)下至凝固腺，上至露出肝臟一角即可，盡量避免長(zhǎng)切口以減少創(chuàng)傷。下腔靜脈比較脆弱易破裂，加上個(gè)別動(dòng)物存在異常解剖結(jié)構(gòu)，故分離時(shí)采用顯微手術(shù)器械小心鈍性分離，動(dòng)作輕柔避免損傷神經(jīng)纖維和輸尿管。④ 預(yù)防感染：器械嚴(yán)格滅菌處理，術(shù)中遵守?zé)o菌操作，青霉素預(yù)防感染。⑤ 預(yù)防腹腔粘連：術(shù)后腹腔中注入1.0 mL生理鹽水。
本研究中，手術(shù)1組和手術(shù)2組DVT重量和長(zhǎng)度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明本實(shí)驗(yàn)DVT模型是穩(wěn)定的。為進(jìn)一步驗(yàn)證模型實(shí)用性，設(shè)置了內(nèi)毒素+手術(shù)組，低劑量?jī)?nèi)毒素可誘導(dǎo)DVT加重，血栓長(zhǎng)度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，血栓重量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍大于手術(shù)2組。可能由于內(nèi)毒素刺激機(jī)體合成與過量釋放細(xì)胞間黏附分子1，最終使出血-凝血機(jī)制失衡，從而促進(jìn)血栓形成。既往研究曾探討過內(nèi)毒素注射后循環(huán)炎性標(biāo)志物變化情況以及血栓病理形態(tài)學(xué)，但該部分不是本研究重點(diǎn)內(nèi)容，故未進(jìn)行重復(fù)[15]。
綜上所述，本研究通過方法學(xué)改進(jìn)，建立一種較理想的DVT小鼠模型。與其他動(dòng)物或不同模型相比，手術(shù)1組和手術(shù)2組建立的動(dòng)物模型具備諸多優(yōu)勢(shì)，其更符合人體DVT的病理生理演變，操作可重復(fù)性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便并且價(jià)格低廉。
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深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)是多種因素引起的靜脈血栓性疾病，多發(fā)生在腿部，并伴有肺栓塞，統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞[1]。DVT成因復(fù)雜，主要有遺傳因素、創(chuàng)傷、血液黏度增大、長(zhǎng)期固定、血管內(nèi)皮功能異常等[2]。患病后易造成肢體殘疾，甚至危及生命，其治療主要包括抗凝[3]和介入治療[4]等。然而DVT病變過程復(fù)雜，病因尚未完全明確，研究DVT形成的信號(hào)傳導(dǎo)通路、標(biāo)志性的早期預(yù)警因子、預(yù)防和治療的藥物研發(fā)都離不開動(dòng)物模型。小鼠因具有價(jià)廉、操作方便、可重復(fù)性強(qiáng)、符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則[5]等特點(diǎn)而成為DVT研究的首選動(dòng)物。小鼠DVT模型制備的質(zhì)量及成功率將直接影響實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)度和可信度，目前系統(tǒng)討論小鼠DVT模型制備方法的報(bào)道較少。本研究旨在構(gòu)建一種操作性、可行性和實(shí)用性強(qiáng)的小鼠DVT模型，探討相關(guān)構(gòu)建的方法。
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1.2 DVT模型制備
1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備及超聲評(píng)估 實(shí)驗(yàn)小鼠術(shù)前4 h禁水，12 h禁食，稱重，用2%異氟醚-氧(氧濃度100%)混合物麻醉小鼠，待小鼠安靜、呼吸平穩(wěn)后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)。使用Visual Sonics帶有40 MHz小鼠掃描頭的Vevo 2100 系統(tǒng)獲得下腔靜脈和周圍結(jié)構(gòu)、血管以及血流的圖像。
1.2.2 分離下腔靜脈 腹部消毒，沿其腹白線切開，切口不要太長(zhǎng)，下至凝固腺，上至露出肝臟一角即可。用濕棉簽小心撥出小腸等器官置于小鼠左側(cè)，用溫生理鹽水浸濕的紗布包裹，顯露下腔靜脈。在解剖顯微鏡下辨別下腔靜脈和腹主動(dòng)脈以及旁邊的輸尿管和神經(jīng)，用顯微器械小心地在腎動(dòng)脈分叉水平以下節(jié)段，將下腔靜脈與主動(dòng)脈分離，結(jié)扎所有下腔靜脈側(cè)支。
1.2.3 下腔靜脈結(jié)扎及術(shù)后即刻超聲評(píng)估 參考Ponomaryov等[6]方法，將1根30 G的針頭與下腔靜脈用7-0聚丙烯縫線一并綁繞，再移除針頭，該方法可使下腔靜脈面積縮小約90%，且不損傷血管內(nèi)皮。腹腔中加入8 000 U青霉素預(yù)防傷口感染，用5-0縫合線逐層縫合腹腔。迅速在下腔靜脈所在區(qū)域覆蓋超聲凝膠，使用Vevo 2100超聲影像系統(tǒng)獲得下腔靜脈和周圍結(jié)構(gòu)、血管以及血流的圖像。隨后紗布清潔和碘伏消毒。
1.2.4 術(shù)后護(hù)理 將小鼠置于25～28 ℃的環(huán)境中，直至復(fù)蘇。保持墊料清潔干燥，常規(guī)飼養(yǎng)及飲水，監(jiān)測(cè)小鼠精神狀態(tài)、食欲、傷口恢復(fù)和體重情況。術(shù)后肌注青霉素8 000萬/d預(yù)防傷口感染。
1.3 標(biāo)本的獲取及測(cè)量
造模術(shù)后48 h，用90 mg/kg、5%戊巴比妥鈉腹腔注射小鼠，致過量麻醉后處死小鼠。沿腹白線開腹，移開小腸等器官，顯露下腔靜脈。在下腔靜脈的結(jié)扎處下方，取出結(jié)扎線遠(yuǎn)心端長(zhǎng)度為1.0 cm的下腔靜脈段血管，小心分離血栓，進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，超聲測(cè)得的血栓面積和按比例確定的血栓重量顯示出很強(qiáng)的相關(guān)性(r2=0.96)。因此，本研究中使用的手動(dòng)血栓大小評(píng)估方法可以被認(rèn)為是有效的，與傳統(tǒng)的超聲測(cè)量面積的方法相比，更加簡(jiǎn)單便捷。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
2.1 手術(shù)成功率及死亡率
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后死亡視為手術(shù)失敗。正常對(duì)照組的6只小鼠全部存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)；假手術(shù)組小鼠手術(shù)成功率為66.7%(8/12，不合格2只)，術(shù)后死亡率為16.7%(2/12，1只為麻醉意外，1只為出血)；手術(shù)1組小鼠手術(shù)成功率為66.7%(8/12)，術(shù)后死亡率為25.0%(3/12，1只為麻醉意外，1只為出血，1只為感染)；手術(shù)2組小鼠手術(shù)成功率為75.0%(9/12)，術(shù)后死亡率為25.0%(3/12，2只為出血，1只為感染)；內(nèi)毒素+手術(shù)組手術(shù)成功率為50.0% (7/14，不合格1只)，術(shù)后死亡率為42.8%(6/14，2只為出血，4只為感染)。內(nèi)毒素+手術(shù)組有4例動(dòng)物在注射內(nèi)毒素后死亡，不能排除由內(nèi)毒素引起，故在計(jì)算下腔靜脈狹窄術(shù)手術(shù)總死亡率和成功率時(shí)，僅納入手術(shù)1組和手術(shù)2組數(shù)據(jù)。下腔靜脈狹窄手術(shù)的小鼠共24只，下腔靜脈狹窄術(shù)總死亡率為25.0%(6/24)，總成功率為70.8%(17/24)。死亡原因主要為麻醉意外、術(shù)中或術(shù)后出血、傷口感染。在觀察終點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組存活動(dòng)物體重?zé)o明顯差異。
2.2 麻醉效果
用異氟醚在自制麻醉盒里誘導(dǎo)麻醉30～40 s，隨后以2%異氟醚-氧混合物持續(xù)麻醉小鼠，維持效果好，以動(dòng)物安靜、捏腳趾反射消失和呼吸平穩(wěn)為完全麻醉表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)麻醉意外死亡2只，均為瘦弱個(gè)體，推測(cè)可能也與異氟醚誘導(dǎo)麻醉時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)(>50 s)。
2.3 手術(shù)成功評(píng)價(jià)
圖1顯示的是小鼠DVT模型構(gòu)建過程，白光及血管超聲圖片。在小鼠的下腔靜脈未結(jié)扎前，超聲顯示血流清晰且通暢，下腔靜脈易于壓縮。在下腔靜脈結(jié)扎并拔掉30 G針頭后即刻，超聲可見結(jié)扎線遠(yuǎn)端一束來自后側(cè)支的靜脈血流注入下腔靜脈的信號(hào)，說明仍有靜脈血流通過結(jié)扎點(diǎn)，表明血栓模型造模成功。
2.4術(shù)后動(dòng)物基本情況和取材前大體觀
所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物術(shù)后2～3 h逐漸開始活動(dòng)，24 h后活動(dòng)量明顯增大，內(nèi)毒素+手術(shù)組小鼠活動(dòng)稍差、精神欠佳、食欲減退。正常對(duì)照組和假手術(shù)組下腔靜脈管徑粗細(xì)均勻，管壁薄而柔軟，內(nèi)膜面平整、光滑。手術(shù)1組、手術(shù)2組和內(nèi)毒素+手術(shù)組小鼠術(shù)后48 h形成DVT的下腔靜脈血管段血管彈性下降，腹腔內(nèi)均可見腸系膜靜脈血管明顯擴(kuò)張，腸蠕動(dòng)減弱，并可見輕-中度腸脹氣。
A：下腔靜脈結(jié)扎時(shí)，箭頭所示為30G針頭；B：下腔靜脈 90%結(jié)扎后即刻；C：結(jié)扎前下腔靜脈超聲圖，箭頭所示為下腔靜脈血流信號(hào)；D：下腔靜脈結(jié)扎后超聲圖，箭頭所示為后側(cè)支靜脈血流信號(hào)
2.5 血栓重量與長(zhǎng)度
各組血栓形成情況如圖2所示。以同一批次小鼠形成血栓的重量和長(zhǎng)度是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，來評(píng)估DVT模型的穩(wěn)定性。手術(shù)1組與手術(shù)2組的下腔靜脈血栓重量和長(zhǎng)度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[重量：(5.58±3.98) mgvs.(5.80±4.33)mg，t=-0.105，P=0.918；長(zhǎng)度：(3.30±1.92) mmvs.(3.51±2.45)mm,t=-0.196，P=0.847]。與手術(shù)2組相比，內(nèi)毒素+手術(shù)組血栓長(zhǎng)度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(6.37±2.08)mmvs.(3.51±2.45)mm，t=2.469，P=0.027]，血栓重量也增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(9.81±4.72)mgvs.(5.80±4.33)mg，t=1.771，P=0.098]。正常對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1組、手術(shù)2組和內(nèi)毒素+手術(shù)組形成血栓例數(shù)占比依次為0、0、87.5%、77.7%和100%。
圖2 各實(shí)驗(yàn)組血栓形成情況
3 討論
DVT是血液在深靜脈內(nèi)不正常凝結(jié)引起的靜脈回流障礙性疾病。深入研究其致病機(jī)理，對(duì)改善患者癥狀、降低并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率有重要意義。而建立穩(wěn)定可靠且符合臨床DVT特點(diǎn)的動(dòng)物模型是這一問題的研究基礎(chǔ)。
既往研究嘗試多種不同的動(dòng)物制備模型[8]。楊軍等[9]認(rèn)為，在血栓機(jī)化的早期階段，不同動(dòng)物個(gè)體間存在著相似的規(guī)律。目前小鼠應(yīng)用最為廣泛，其優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在[10]：① 標(biāo)準(zhǔn)“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物”可受到全面控制，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性；② 技術(shù)操作的可行性高；③成本低，易于取得。
眾多危險(xiǎn)因素均是通過Virchow提出的血栓形成3大要素，即血管壁損傷、血流緩慢、血液高凝狀態(tài)而促進(jìn)靜脈血栓的形成[11]。目前常采用的方法有[12]：① 下腔靜脈狹窄法，通過外力加壓下腔靜脈導(dǎo)致穩(wěn)定的層狀血栓形成。該法保證近心端通暢，更符合人體血栓形成特點(diǎn)，形成血栓時(shí)間較長(zhǎng)，量少且數(shù)值相差不大。適合血栓溶解和再通的實(shí)驗(yàn)研究。② 下腔靜脈結(jié)扎法，通過手術(shù)閉塞下腔靜脈，從而損傷血管，暴露血管內(nèi)皮下膠原纖維，并造成局部低氧環(huán)境和炎癥反應(yīng)，最終激活凝血系統(tǒng)[13]。該法不能保障血栓的近心端通暢，不適合藥物研究。③ 電解損傷法，即將直流電通過導(dǎo)線誘導(dǎo)血管內(nèi)自由基形成，從而使內(nèi)皮細(xì)胞活化，誘發(fā)形成血栓。該模型可用于血栓治療藥物研發(fā)，但手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)，并可使靜脈壁完整性破壞。本研究使用了上述第一種方法，即下腔靜脈狹窄法。在該模型中，下腔靜脈管腔體積減小了約 90%。血栓形成由內(nèi)皮細(xì)胞活化啟動(dòng)，形成于血流速度降低的狹窄點(diǎn)遠(yuǎn)心端。在組織學(xué)上觀察到該模型中形成的血栓也與人類靜脈血栓相似[14]。因此基于該模型所獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有一定的參考價(jià)值。
本實(shí)驗(yàn)總結(jié)提高成功率降低死亡率的要點(diǎn)如下，① 動(dòng)物質(zhì)量、飼養(yǎng)環(huán)境及術(shù)前護(hù)理：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。術(shù)前12 h禁食、4 h禁水，避免過多消化道內(nèi)容物影響手術(shù)過程，降低術(shù)后發(fā)生腸梗阻等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。② 麻醉效果：本實(shí)驗(yàn)麻醉意外死亡2只，推測(cè)可能與自身體弱及異氟醚誘導(dǎo)麻醉時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)。小鼠體型小，應(yīng)注意避免麻醉藥物過量。③ 預(yù)防出血和組織損傷：切口應(yīng)下至凝固腺，上至露出肝臟一角即可，盡量避免長(zhǎng)切口以減少創(chuàng)傷。下腔靜脈比較脆弱易破裂，加上個(gè)別動(dòng)物存在異常解剖結(jié)構(gòu)，故分離時(shí)采用顯微手術(shù)器械小心鈍性分離，動(dòng)作輕柔避免損傷神經(jīng)纖維和輸尿管。④ 預(yù)防感染：器械嚴(yán)格滅菌處理，術(shù)中遵守?zé)o菌操作，青霉素預(yù)防感染。⑤ 預(yù)防腹腔粘連：術(shù)后腹腔中注入1.0 mL生理鹽水。
本研究中，手術(shù)1組和手術(shù)2組DVT重量和長(zhǎng)度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明本實(shí)驗(yàn)DVT模型是穩(wěn)定的。為進(jìn)一步驗(yàn)證模型實(shí)用性，設(shè)置了內(nèi)毒素+手術(shù)組，低劑量?jī)?nèi)毒素可誘導(dǎo)DVT加重，血栓長(zhǎng)度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，血栓重量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍大于手術(shù)2組。可能由于內(nèi)毒素刺激機(jī)體合成與過量釋放細(xì)胞間黏附分子1，最終使出血-凝血機(jī)制失衡，從而促進(jìn)血栓形成。既往研究曾探討過內(nèi)毒素注射后循環(huán)炎性標(biāo)志物變化情況以及血栓病理形態(tài)學(xué)，但該部分不是本研究重點(diǎn)內(nèi)容，故未進(jìn)行重復(fù)[15]。
綜上所述，本研究通過方法學(xué)改進(jìn)，建立一種較理想的DVT小鼠模型。與其他動(dòng)物或不同模型相比，手術(shù)1組和手術(shù)2組建立的動(dòng)物模型具備諸多優(yōu)勢(shì)，其更符合人體DVT的病理生理演變，操作可重復(fù)性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便并且價(jià)格低廉。
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