尿酸通過下調lncRNA MIR22HG的表達促進前列腺癌細胞增殖及遷移

李安蘇， 邵世和， 王秀平， 朱華姿， 胡建鵬

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇大學附屬人民醫院泌尿外科，江蘇 鎮江 212002)

2021年全球癌癥統計數據顯示，前列腺癌是男性發病率第一，死亡率第二的惡性腫瘤[1]，該病目前已知致病因素有遺傳易感性、飲食、環境因素、慢性炎癥、免疫失調等[2]。有報道指出，在良性前列腺增生患者中，高尿酸與血清前列腺特異抗原成正相關[3]。一項長期隨訪研究發現，高尿酸與前列腺癌的發生相關，是疾病發生的重要預測因子[4]。深入的機制研究證實[5-6]，尿酸作為一種抗氧化劑，可以促進腫瘤細胞的增殖、遷移。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼RNA分子，可以在表觀遺傳、轉錄水平或轉錄后水平等多種層面調控基因表達，進而廣泛參與腫瘤的發生發展[7]。近期越來越多的研究證明，lncRNA作為抑癌或者原癌基因，廣泛參與腫瘤細胞的增殖、轉移、凋亡及血管生成[8-10]。Shen等[11]研究發現lncRNA MIR22HG在前列腺癌中表達下降，且高表達的患者預后更好，這提示其可能調控前列腺癌的進展。本研究旨在探究尿酸與前列腺癌細胞MIR22HG表達的關系，并進一步分析兩者在前列腺癌細胞增殖、遷移中的作用，為前列腺癌的診治提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

尿酸購自美國Sigma公司，溶于1 mmol/L的NaOH中，之后用PBS配制成5 mmol/L尿酸溶液，并用細胞培養基稀釋成濃度為400 μmol/L備用。胎牛血清、DMEM均購自美國Gibco公司。pcDNA、pcDNA-MIR22HG，si-NC、si-MIR22HG購自上海吉瑪公司。Lipofectamine 3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。RNA分離試劑、CCK-8、逆轉錄試劑盒HiSript Ⅲ RT Super Mix、實時定量PCR試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均購自中國諾維贊公司。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(P21)、細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、GAPDH兔抗人一抗和HRP標記的羊抗兔二抗均為美國Proteintech公司產品。

1.2 細胞培養與處理

前列腺癌DU145細胞購自上海細胞庫，并培養于含10%胎牛血清的DMEM中，培養條件為37 ℃、5% CO2，以 1×106個/孔接種于 6 孔培養板，待細胞融合度達70%～80% 時，進行后續實驗。根據文獻報道[12]和前期預實驗結果，選取400 μmol/L尿酸用于后續研究中處理DU145細胞。

對照組用上述高糖培養基培養，尿酸處理組加入含400 μmol/L尿酸的培養基，處理48 h后進行后續實驗。

轉染組細胞按說明使用Lipofectamine 3000試劑進行轉染，按分組每孔加入10 μL si-MIR22HG或si-NC，2.5 μg pcDNA或 pcDNA-MIR22HG，待培養48 h后收集RNA、蛋白及細胞行后續研究。si-MIR22HG序列為CCCUUAGCAAACCAUAACATT，si-NC序列為UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。

pcDNA-MIR22HG過表達+尿酸刺激實驗分組：pcDNA組(轉染pcDNA)、UA+pcDNA組(轉染pcDNA+400 μmol/L尿酸)和UA+pcDNA-MIR22HG組(轉染pcDNA-MIR22HG+400 μmol/L尿酸)，待培養48 h后收集RNA、蛋白及細胞行后續研究。

1.3 CCK-8法檢測前列腺癌DU145細胞的增殖能力

按照“1.2”中的方法處理細胞后，收集各組細胞，以2×103/孔接種到96孔板培養12 h后，更換培養液，在相應組中加入400 μmol/L尿酸培養48 h后，加入10 μL CCK8孵育1 h，在酶標儀450 nm處測量光密度(D)值。

1.4 蛋白質印跡法檢測細胞周期相關蛋白表達水平

收集各組前列腺癌DU145細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白質濃度。蛋白質變性后進行SDS-PAGE，80 V 1 h后增加電壓至120 V再電泳1 h; 300 mA轉膜2 h后，將凝膠分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。PVDF膜洗滌后5%脫脂牛奶封閉1 h;分別加入兔抗人Cyclin D1(1 ∶1 000)、P21(1 ∶1 000)、CDK4(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 500)一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜4次，每次15 min，加HRP標記的羊抗兔二抗(1 ∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次15 min，洗膜完畢后加入ECL發光底物曝光。

1.5 qRT-PCR檢測前列腺癌DU145細胞中MIR22HG表達水平

使用RNA分離試劑提取細胞總RNA，NanoDrop 3000檢測RNA濃度。之后使用HiSript Ⅲ RT Super Mix兩步法逆轉錄試劑將提取的RNA逆轉錄成cDNA，ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix進行qPCR,反應條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；共40個循環。GAPDH作為內參。MIR22HG引物序列：上游5′-TGGAGACCAGTGAAGGACCA-3′，下游5′-ACATCTCGGAGGCAGAA-AGC-3′；GAPDH引物序列:上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3，下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGAC-3′。通過2-ΔΔCt方法計算MIR22HG相對表達量。

1.6 Transwell法檢測前列腺癌DU145細胞的遷移能力

收集各組DU145細胞，使用無血清DMEM重懸細胞，調整細胞密度為2×105個/mL。選擇直徑8 μm的Transwell小室進行實驗，上室加入200 μL細胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的培養基。孵育48 h后取出小室，使用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，最后在光學顯微鏡下計數穿膜細胞并統計。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 尿酸促進前列腺癌DU145細胞的增殖及遷移能力

CCK-8檢測結果顯示，400 μmol/L尿酸可以明顯促進DU145細胞的增殖(t=7.45，P<0.01)。蛋白質印跡結果顯示，400 μmol/L尿酸處理后DU145細胞Cyclin D1(t=9.22，P<0.01)和CDK4蛋白表達明顯升高(t=16.91，P<0.01)，P21蛋白表達明顯降低(t=10.77，P<0.01)。Transwell檢測結果顯示，與對照組相比，尿酸處理組DU145細胞的遷移細胞數顯著增多(t=24.61，P<0.01)。見圖1。

A: CCK-8檢測細胞增殖能力；B:蛋白質印跡檢測細胞周期相關蛋白；C：Transwell檢測細胞遷移能力(×200)。*：P<0.01，與對照組比較

2.2 尿酸下調前列腺癌DU145細胞中MIR22HG的表達水平

用400 μmol/L的尿酸處理DU145細胞48 h后，qRT-PCR檢測結果顯示，尿酸處理組DU145細胞中MIR22HG相對表達量較對照組明顯下降(t=10.16，P<0.01)。見圖2。

*：P<0.01，與對照組比較

2.3 過表達MIR22HG抑制前列腺癌DU145細胞增殖和遷移

與pcDNA組相比，轉染MIR22HG過表達質粒后，MIR22HG表達顯著升高(t=4.96，P<0.01)；細胞增殖能力明顯降低(t=6.76，P<0.01)；Cyclin D1(t=8.39，P<0.01)和CDK4(t=8.49，P<0.01)表達明顯降低，P21表達明顯升高(t=7.34，P<0.01)；遷移細胞數明顯減少(t=7.97，P<0.01)。見圖3。

A：qRT-PCR檢測細胞內MIR22HG表達水平；B: CCK-8檢測細胞增殖能力；C:蛋白質印跡檢測細胞周期相關蛋白；D：Transwell檢測細胞遷移能力(×200)。*：P<0.01，與pcDNA組比較

2.4 敲減MIR22HG促進前列腺癌DU145細胞增殖和遷移

轉染48 h后檢測結果顯示，與si-NC組相比，轉染si-MIR22HG后，MIR22HG表達顯著降低(t=5.43，P<0.01)；細胞增殖能力明顯升高(t=6.14，P<0.01)；Cyclin D1(t=8.23，P<0.01)和CDK4蛋白(t=5.53，P<0.01)表達明顯升高，P21蛋白表達明顯降低(t=6.13，P<0.01)；遷移細胞數明顯增多(t=7.29，P<0.01)。見圖4。

A：qRT-PCR檢測細胞內MIR22HG表達水平；B: CCK-8檢測細胞增殖能力；C:蛋白質印跡檢測細胞周期相關蛋白表達；D：Transwell檢測細胞遷移能力(×200)。*：P<0.01，與si-NC組比較

2.5 過表達MIR22HG可以逆轉尿酸對DU145細胞增殖及遷移能力的促進作用

轉染48 h后結果顯示，與UA+pc-DNA組相比，UA+pcDNA-MIR22HG組細胞增殖能力明顯下降(F=44.83，P<0.01)；Cyclin D1和CDK4表達明顯降低，P21表達明顯升高(F值分別為25.29、43.80、12.66，P均<0.01)；遷移細胞數明顯減少(F=26.80，P<0.01)。見圖5。

A：CCK-8檢測細胞增殖能力；B:蛋白質印跡檢測細胞周期相關蛋白的表達水平；C：Transwell檢測細胞遷移能力(×200)。①: pcDNA組; ②: UA+pcDNA組; ③: UA+pcDNA-MIR22HG組。*：P<0.01，與①比較；#：P<0.01，與②比較

3 討論

尿酸是嘌呤代謝途徑的最終產物，具有多種生物活性，可通過調控氧化應激、慢性炎癥，進而在腫瘤發生發展中發揮重要調控作用[4]。另一方面，尿酸作為促氧化劑，通過進入正常細胞促進腫瘤細胞的增殖及遷移，在活性氧和炎癥應激的介導下，促進腫瘤的發生[5-6]。尿酸與多種腫瘤的發生、預后、進展密切相關。研究表明，肝癌患者尿酸升高，提示預后不良[13]。尿酸可作為胰腺癌診斷和預后的生物標志物，其水平升高與患者死亡率升高密切相關[14]。高尿酸可作為頭頸部癌診斷的分子標志物，且與患者不良預后相關[15]。在前列腺癌的研究中，尿酸的作用機制并不明確。Kolonel等[16]通過對7889名男性的10年隨訪，發現高尿酸與前列腺癌的發生呈正相關。Hammarsten等[17]的研究證明尿酸是前列腺癌發生的危險因素之一。與此同時，也有一些臨床隨訪數據指出，尿酸可能與前列腺癌的發生無關[18]，甚至在前列腺癌的發展中發揮保護作用[19]。尿酸在前列腺癌研究中的矛盾結果，可能與臨床樣本的選擇差異、統計方法的不同相關。本研究結果顯示，尿酸刺激后，前列腺癌細胞的增殖及遷移能力顯著增強，這也證實了尿酸對前列腺癌的促進作用。此結果為靶向尿酸用于前列腺癌的臨床治療提供了新的理論依據，然而尿酸調控前列腺癌細胞增殖、遷移的相關分子機制尚未明確。

近年來，隨著高通量測序技術的開展，大量的非編碼RNA(ncRNAs)被發現。隨著對其功能的深度探索，研究者發現這些ncRNAs可以調控機體的生理、病理進程[20]。LncRNA是ncRNA中的重要一員，其轉錄本長度超過200個核苷酸。研究發現，lncRNA具有組織和細胞特異性，其表達受到精確調節，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用[10]。張鶴騰等[9]發現lncRNA SPATA3-AS1在胃癌組織中高表達，且其表達水平與胃癌淋巴結轉移及腫瘤TNM分期相關。敲減lncRNASPATA3-AS1后胃癌細胞增殖、遷移及侵襲等能力減弱。Li等[21]通過體內體外實驗證明，lncRNA-DLEU2在進展期前列腺癌組織中表達升高，且與患者預后呈負相關，其能夠靶向miR-582-5p-SGK1信號軸，進而促進前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。近期，一系列研究指出MIR22HG在腫瘤中發揮重要的抑癌作用。MIR22HG低表達預示肝癌患者臨床預后較差[22]。MIR22HG在乳腺癌中呈低表達，上調其表達可以抑制乳腺癌細胞的增殖與遷移[23]。與正常結腸組織相比，癌組織內MIR22HG表達下調，且過表達MIR22HG可以促進T細胞浸潤進而增強結腸癌免疫治療的療效[24]。MIR22HG作為一種重要的抑癌因子，其與前列腺癌的研究較少。Shen等[11]通過生物信息學分析發現，MIR22HG在前列腺癌組織中表達下降，且與前列腺癌患者生存預后相關。本研究證明MIR22HG是調控前列腺癌細胞的關鍵分子，過表達MIR22HG可以抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移能力，而敲減MIR22HG可以促進其增殖和遷移能力。尿酸是否通過影響MIR22HG而發揮促進前列腺癌增殖和遷移的作用尚無報道。在我們的研究中，尿酸處理后，前列腺癌細胞內MIR22HG的表達降低，表明尿酸對MIR22HG具有負調控作用。進一步實驗結果提示過表達MIRR22HG后，尿酸對前列腺癌細胞增殖和遷移能力的促進作用被逆轉。

綜上所述，本研究初步證明MIR22HG是參與調控尿酸誘導前列腺癌細胞增殖和遷移的重要分子，然而尿酸作為調控腫瘤的重要因素，除了lncRNA，其下游可能有多種分子的參與。同時，lncRNA具有復雜的調控模式，MIR22HG具體通過調控何種分子，也有待于進一步的探索。