干性增強的小鼠胚胎成纖維細胞來源的擠壓囊泡抑制多種腫瘤細胞生長

房文靜，楊夢婷，張俊堯，費菲，李麗，陳茜，李張左，侯寒進，龔愛華

(江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013)

近來，干細胞調控腫瘤微環境的作用引起廣泛的關注。干細胞可以定向遷移至腫瘤局部，抑制腫瘤細胞生長并使其向良性表型轉化，相對于傳統的腫瘤治療具有安全性高和不良反應小等優勢[1-2]。研究發現，小分子化合物可以誘導小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)轉變為多能干細胞，具有安全性高、成本低和易操作等優勢[3]。研究表明，β-煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)、雷帕霉素、維生素C等小分子藥物具有誘導或維持干細胞干性的作用[4-6]。此外，在2D培養中，干細胞的多種特性可能會降低甚至喪失，3D培養則可提供更完整的細胞與細胞和細胞與基質相互作用的微環境。在3D培養中，細胞所需的多種特性得以保持甚至促進[7]。

八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)基因主要在胚胎干細胞及生殖干細胞中表達，對于維持胚胎干細胞的多潛能性和自我更新具有重要作用，也是產生誘導多能干細胞的必要因子[8]。Nanog基因主要在胚泡的內細胞團中表達，其與細胞分裂、分化情況以及細胞的干細胞特性密切相關[9]。干細胞通過釋放各種旁分泌因子如細胞外囊泡和可溶性物質等發揮功能，這些因子可影響腫瘤的發生、發展和轉移[10-11]。近來研究發現，從間充質干細胞上清液中提取的微囊泡在體內外均有明顯的抗腫瘤效應[12]。此外，經間充質干細胞擠壓出的囊泡產出率高，且與分泌至細胞外的微囊泡具有相似的特征和功能[13]。但是，干細胞擠壓囊泡是否具有與干細胞來源的外泌體功能類似的抗腫瘤效應尚不清楚。因此，本研究擬篩選小分子藥物NMN、甜菜堿、維生素C和雷帕霉素促進MEF干性的最適濃度和最適組合，并將篩選出的組合與3D培養相結合，進而將篩選出的干性增強的MEF擠壓成囊泡，探究其對腫瘤細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 MEF、小鼠膠質母細胞瘤GL261細胞系、小鼠肺癌細胞Lewis和小鼠肝癌細胞Hepa1-6均由江蘇大學醫學院細胞生物學研究室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM購自美國Hyclone公司；澳洲胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol裂解液、2×SYBR Green Mix溶液、CCK8試劑盒均購自南京諾唯贊公司；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；Matrigel膠購買自美國BD公司；兔抗人β-微管蛋白抗體購自英國Abcam公司；干性指標相關兔抗小鼠Oct-4抗體和兔抗小鼠Nanog抗體購自美國Cell公司；NMN、雷帕霉素、甜菜堿等均購自美國MCE公司；ECL發光液購買自美國Millipore Immobilon公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MEF、Lewis、Hepa1-6和GL261細胞用含谷氨酰胺、5 μg/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM，于5% CO2，37 ℃的培養箱中培養。

1.2.2 篩選促進MEF干性的小分子藥物

1.2.2.1 藥物配制及處理 用培養液配制1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L濃度梯度的NMN和甜菜堿，10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L濃度梯度的維生素C和雷帕霉素，另設不加藥物的培養基作為對照，加入MEF培養體系中培養72 h。

1.2.2.2 qRT-PCR檢測不同濃度藥物處理細胞中Oct-4mRNA相對表達量 用Trizol提取“1.2.2.1”不同濃度梯度NMN、甜菜堿、雷帕霉素和維生素C處理的MEF總RNA，用逆轉錄試劑盒行逆轉錄，獨立樣本均設3個復孔并將其逆轉錄成cDNA。配置10 μL反應體系，4.1 μL DEPC水、5 μL SYBR Premix ExTaqⅡ和上、下游引物各0.2 μL、0.5 μL cDNA混合均勻后加入8聯管中。95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃退火30 s，40個循環。根據NCBI查找的基因序列設計引物，Oct-4mRNA上游引物為5′-TTAAGAACATGTGTAAGCTGCG-3′，下游引物為5′-GCATATCTCCTGAAGGTTCTCA-3′。將GAPDH設為內參，以2-ΔΔCt計算Oct-4mRNA相對表達量，實驗重復3次。篩選出NMN、甜菜堿、雷帕霉素和維生素C最適濃度。

1.2.3 篩選促進MEF干性的小分子藥物組合

1.2.3.1 藥物分組及處理 將NMN、甜菜堿、雷帕霉素和維生素C按照篩選出的最適濃度進行互相組合，兩兩組合為NMN+雷帕霉素、NMN+甜菜堿、NMN+維生素C、雷帕霉素+甜菜堿、雷帕霉素+維生素C、甜菜堿+維生素C；3種互相組合為NMN+甜菜堿+雷帕霉素、NMN+維生素C+雷帕霉素、NMN+甜菜堿+維生素C、甜菜堿+雷帕霉素+維生素C；4種相互組合為NMN+雷帕霉素+甜菜堿+維生素C；將不同組合分別加入MEF培養體系中培養72 h。

1.2.3.2 qRT-PCR檢測不同處理組細胞Oct-4mRNA相對表達量 采用Trizol提取“1.2.3.1”中MEF總RNA，其余操作同“1.2.2.2”。

1.2.3.3 CCK8法檢測細胞增殖 將MEF接種于96孔板，每孔接種3 000個細胞(100 μL培養基)，于37 ℃，5% CO2培養箱培養12 h；觀察細胞生長狀態，分別加入10 μmol/L NMN、10 μmol/L雷帕霉素、10 μmol/L甜菜堿、100 μmol/L維生素C以及“1.2.3.1”所述小分子藥物組合，每組設3個復孔，孵育72 h；每孔加入10 μL CCK8溶液，孵育1～4 h；用酶標儀測定450 nm處光密度(D)值。細胞活性(%)=(D實驗組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100%。

1.2.4 小分子藥物聯合3D培養體系的建立

1.2.4.1 3D培養體系的建立 取處于對數生長期的MEF，胰酶消化，制備成細胞懸液，計數5×105個細胞，加入至10 μL Matrigel基質膠中；將與細胞混勻的基質膠滴到預熱的24孔板中；待膠滴凝固呈凸起的穹頂狀時，每孔加入500 μL無血清條件培養基，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。

1.2.4.2 藥物分組及處理 將NMN+甜菜堿、雷帕霉素+甜菜堿、甜菜堿+維生素C藥物組合分別加入至3D培養體系中，以未經藥物處理的3D培養體系為對照，每隔一天記錄MEF生長狀態。在第6天時，顯微鏡(40×)下計數直徑大于50 μm的克隆球個數。

1.2.4.3 蛋白質印跡法檢測相關蛋白表達 制備含1% PMSF的蛋白裂解液，分別收集未經藥物處理的2D培養、未經藥物處理的3D培養、NMN+甜菜堿聯合3D培養、甜菜堿+雷帕霉素聯合3D培養、甜菜堿+維生素C聯合3D培養6 d后的MEF，加入裂解液，充分裂解后，100 ℃加熱10 min；4 ℃，12 000×g離心10 min；配制10%的SDS-PAGE分離膠，加入蛋白，80 V電泳120 min分離樣品；300 mA轉膜150 min將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；加入一抗(Oct-4抗體、Nanog抗體，均1 ∶2 000稀釋，β-微管蛋白抗體1 ∶5 000稀釋)于4 ℃孵育過夜；TBST溶液洗膜3次；37 ℃孵育二抗(1 ∶10 000稀釋)1 h；TBST溶液清洗3次；ECL發光液顯色，灰度分析軟件Image J 5.0分析圖像。

1.2.4.4 qRT-PCR檢測不同處理組細胞Oct-4mRNA相對表達量 以不加任何藥物處理的2D培養體系的MEF為對照組，按照“1.2.3.1”分組將藥物進行組合，分別加入至3D培養體系的MEF中，培養72 h后提取RNA，qRT-PCR檢測不同處理組細胞Oct-4mRNA相對表達量，方法同“1.2.2.2”。

1.2.5 擠壓法收集細胞囊泡及粒徑測定

1.2.5.1 囊泡制備 取2D培養的MEF，胰酶消化，離心收集后計數。NMN+甜菜堿聯合3D培養體系與3D培養體系的MEF通過收集板表面凝固的膠滴到1.5 mL EP管中，在1 mL室溫解離緩沖液中(EDTA胰蛋白酶)重新懸浮顆粒，200×g離心5 min，棄上清液；加入1 mL預冷的培養基，4 ℃，500×g離心5 min，棄上清液，用培養基重懸后計數。將細胞分別通過10 μm、1 μm、200 nm的聚碳酸酯膜，通過反復抽濾使其擠壓成200 nm左右的小囊泡。

1.2.5.2 囊泡分組與粒徑分析 根據囊泡來源不同，分成2D囊泡組、3D囊泡組與干性明顯增強的NMN+甜菜堿聯合3D囊泡組，將“1.2.5.1”細胞擠壓出的囊泡分別梯度稀釋104倍，采用32 W、50 Hz的超聲儀器超聲15 min；采用NanoZS90粒徑分析儀檢測囊泡粒徑。

1.2.6 細胞分組及擠壓囊泡處理 將Hepa1-6、Lewis、GL261和MEF接種至96孔板，每孔3 000個細胞，培養過夜；分別以不加任何處理的Hepa1-6、Lewis、GL261和MEF為對照組，取“1.2.5”擠壓所得囊泡分別加入96孔板中(每孔加入相當于3 000個細胞擠壓的囊泡數)，同時為了防止藥物本身對腫瘤細胞增殖的影響，每孔加入NMN、甜菜堿、NMN+甜菜堿，每組設3個復孔，繼續培養72 h；CCK8法檢測細胞增殖情況，方法同“1.2.3.3”。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度小分子藥物對MEF干性的影響

用不同濃度梯度的小分子藥物處理MEF，qRT-PCR結果顯示，相對于未經藥物處理的細胞，1 μmol/L NMN抑制Oct-4mRNA表達，10 μmol/L促進Oct-4mRNA表達(圖1A，P<0.05)；甜菜堿在10 nmol/L和10 μmol/L時促進Oct-4mRNA表達，且10 μmol/L時效果更明顯(圖1B，P<0.05)；維生素C在100 nmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L時促進Oct-4mRNA表達，且100 μmol/L效果更明顯，但是1 μmol/L和1 mmol/L抑制Oct-4mRNA表達(圖1C，P<0.05)；雷帕霉素10 μmol/L和100 μmol/L促進Oct-4mRNA表達，且10 μmol/L作用效果更明顯，1 mmol/L抑制Oct-4mRNA表達(圖1D，P<0.05)。上述結果表明，NMN、雷帕霉素和甜菜堿促進MEF干性的最適濃度為10 μmol/L，維生素C最適濃度為100 μmol/L。

A：MEF細胞在6種濃度梯度NMN處理下Oct-4 mRNA表達量；B：MEF細胞在6種濃度梯度甜菜堿處理下Oct-4 mRNA表達量；C：MEF細胞在6種濃度梯度維生素C處理下Oct-4 mRNA表達量；D：MEF細胞在6種濃度梯度雷帕霉素處理下Oct-4 mRNA表達量；*：P<0.05，與對應的0 nmol/L組比較

2.2 不同藥物組合對MEF干性和增殖能力的影響

qRT-PCR結果表明，兩種藥物組合中NMN+甜菜堿、雷帕霉素+甜菜堿、甜菜堿+維生素C明顯促進Oct-4mRNA表達，且NMN+甜菜堿組相對表達最高(圖2A，P<0.05)。3種藥物組合和4種藥物組合中，與未經藥物處理組相比，甜菜堿+雷帕霉素+維生素C組Oct-4mRNA相對表達量明顯增高，而NMN+甜菜堿+雷帕霉素組、NMN+維生素C+甜菜堿、NMN+維生素C+甜菜堿Oct-4mRNA表相對達量則明顯降低(圖2B，P<0.05)。

A:兩種藥物相互組合對MEF中Oct-4 mRNA表達的影響；B: 3種藥物和4種藥物相互組合對MEF中Oct-4 mRNA表達的影響；C: CCK8法檢測不同藥物和藥物組合處理后MEF增殖情況。*：P<0.05，與未經藥物處理組比較

CCK8結果表明，與未經藥物處理組相比，10 μmol/L雷帕霉素細胞增殖率明顯降低(P<0.05)，兩種藥物組合中雷帕霉素+甜菜堿組細胞增殖率明顯降低(P<0.05)，3種藥物組合和4種藥物組合中，NMN+甜菜堿+雷帕霉素、NMN+雷帕霉素+維生素C、甜菜堿+雷帕霉素+維生素C、NMN+雷帕霉素+甜菜堿+維生素C組細胞增殖率明顯降低(圖2C，P均<0.05)。由此可見，NMN+甜菜堿組合促進MEF干性效果最強，同時不抑制其增殖。

2.3 小分子藥物組合對3D培養體系中MEF干性的影響

MEF在不同3D培養體系中生長，逐漸形成不同數量的克隆球，相對于不加藥物處理的3D培養組，NMN+甜菜堿組聯合3D培養組與甜菜堿+維生素C聯合3D培養組克隆球數目明顯增多，其中NMN+甜菜堿組聯合3D培養組粒徑大于50 μm的克隆球數目最多(圖3A～B，P<0.05)。與2D培養組細胞相比，未經藥物處理的3D培養組和小分子藥物組合聯合3D培養體系細胞Oct-4mRNA表達水平均明顯升高，其中3D培養體系中，NMN+甜菜堿聯合3D培養組細胞中Oct-4mRNA相對表達水平明顯高于其他組，且表達水平最高(圖3C，P<0.05)。在MEF中，NMN+甜菜堿聯合3D培養組Oct-4和Nanog蛋白表達量明顯高于2D培養組、未經藥物處理的3D培養組、甜菜堿+維生素C聯合3D培養組、雷帕霉素+甜菜堿聯合3D培養組(圖3D～3F，P<0.05)。上述結果表明，MEF在3D環境下生長，干性明顯增高，加入篩選出的藥物NMN+甜菜堿組合能夠進一步提高MEF干性。

A：MEF在3D培養和加藥3D培養條件下形態變化；B：不同藥物處理的3D培養體系中直徑大于50 μm的克隆球數比較；C：qRT-PCR檢測不同藥物組合和3D培養對MEF中Oct-4 mRNA表達量的影響；D：蛋白質免疫印跡法檢測MEF中Oct-4和Nanog蛋白表達；E：Nanog蛋白相對表達量灰度分析圖；F：Oct-4蛋白相對表達量灰度分析圖。*：P<0.05，與未經藥物處理組比較；△:P<0.05,與2D培養組比較；#：P<0.05，與未經藥物處理的3D培養組比較

2.4 擠壓法獲得MEF囊泡的表征

將促進細胞干性最強的組合NMN+甜菜堿聯合3D培養體系細胞、3D培養體系細胞和2D培養體系細胞擠壓成囊泡，粒徑分析結果顯示，2D培養體系細胞囊泡平均粒徑為208 nm(圖4A)，3D培養體系細胞囊泡平均粒徑為213 nm(圖4B)，NMN+甜菜堿組3D培養體系細胞囊泡平均粒徑為193 nm(圖4C)。由此可見，細胞已經被擠壓成了200 nm左右的囊泡。

A：2D培養體系擠壓囊泡粒徑分布；B：3D培養體系擠壓囊泡粒徑分布；C：NMN+甜菜堿組3D培養體系擠壓囊泡粒徑分布

2.5 干性增強的MEF擠壓囊泡抑制多種腫瘤細胞生長

CCK8結果表明，與對照組相比，3D囊泡組、NMN+甜菜堿聯合3D囊泡組Hepa1-6、Lewis和GL261細胞增殖率明顯降低(P均<0.05)；與3D囊泡組相比，NMN+甜菜堿聯合3D囊泡組Lewis和GL261細胞增殖率明顯降低(P均<0.05)；與對照組相比，2D囊泡組、3D囊泡組與NMN+甜菜堿聯合3D囊泡組對MEF增殖沒有明顯影響(圖5A)。將NMN+甜菜堿單獨加入4種細胞中，CCK8結果顯示，與未加藥處理的對照組相比，加入NMN和甜菜堿的MEF、Lewis、Hepa1-6和GL261細胞增殖無明顯差異(圖5B)。由此可見，小分子藥物聯合3D培養導致干性增強的MEF擠壓囊泡能夠特異性地抑制Hepa1-6、Lewis和GL261腫瘤細胞生長。

A：CCK8檢測2D、3D和加藥3D組細胞擠壓囊泡對不同腫瘤細胞和MEF生長的影響；B：CCK8檢測NMN和甜菜堿對腫瘤細胞和MEF生長的影響。*：P<0.05，與對照組相比；#：P<0.05，與3D囊泡組相比

3 討論

以往研究發現，小分子化合物能夠代替傳統的基因重編程的方式誘導多能干細胞的產生，提供更加簡單和安全有效的方式來重新賦予成體細胞“多潛能性”[14-15]。本研究選取NMN、甜菜堿、維生素C和雷帕霉素4種具有促進細胞干性潛力的小分子藥物作用于MEF，通過干性指標Oct-4mRNA水平的變化挑選出最適作用濃度。為提高小分子藥物的作用效果，將幾種小分子藥物在最適濃度條件下組合，同時為防止藥物組合影響細胞生長的狀態，通過CCK8分析細胞的增殖情況，篩選出既能促進細胞干性，又能維持細胞生長的小分子藥物組合，即NMN+甜菜堿。

Nanog和Oct-4是有助于胚胎干細胞自我更新的關鍵因子，在胚胎干細胞的全能性維持中起關鍵作用，在未分化的胚胎干細胞中表達量較高[16-17]。3D培養比傳統的2D培養更好地模擬了干細胞所處的微環境，能夠維持干細胞干性[18]。本研究通過比較Nanog和Oct-4的mRNA和蛋白表達水平發現，與2D培養體系相比，在3D培養條件下MEF干性顯著增強，NMN+甜菜堿在3D培養的基礎上能夠進一步增強細胞干性。

早期研究表明，干細胞來源的外泌體具有抑制腫瘤細胞生長的潛力，但是外泌體的提取過程比較繁瑣并且產量低[19]。研究表明，通過擠壓間充質干細胞，可以產生大量的納米囊泡，其產量是外泌體的20倍，并且間充質干細胞擠壓的囊泡具有心肌保護作用和治療潛力，類似于從相同的細胞中提取的細胞外囊泡[13]。本研究通過3D培養和小分子藥物組合獲得干性增強的細胞，擠壓法制備成囊泡作用于Hepa1-6、Lewis、GL261等3種腫瘤細胞和MEF，結果顯示，與2D培養體系細胞擠壓囊泡相比，3D培養體系細胞的擠壓囊泡能夠抑制腫瘤細胞增殖而不影響MEF增殖，而干性更強的NMN+甜菜堿聯合3D培養組MEF囊泡抑制效果更強。由此表明，干性增強的細胞囊泡能夠抑制多種腫瘤細胞生長，具有廣譜性，并且對不同腫瘤細胞抑制效果不同，其具體機制尚未可知，有待進一步研究。

綜上所述，NMN+甜菜堿與細胞的3D培養相結合能夠提高MEF的干性，同時不抑制MEF的生長。干性提高后的MEF擠壓囊泡對腫瘤細胞的生長有一定抑制作用。