分泌粒蛋白3參與神經細胞毒性反應

李樹霖 牛晨凱 李馮銳

(包頭醫學院基礎醫學與法醫學院，內蒙古 包頭 014060)

帕金森病(PD)是中老年常見的神經系統退行性疾病，隨著年齡增長發病人數增多，患者生活質量下降甚至縮短預期壽命。流行病學及病例-對照研究顯示，環境毒素對腦黑質多巴胺能神經元及神經膠質細胞有毒性作用，長期接觸可引發PD〔1〕。分泌粒蛋白(SCG)3屬于分泌粒家族，廣泛且特異地分布于神經細胞、神經內分泌細胞及內分泌細胞，是研究中樞神經系統分泌顆粒及內分泌腺體功能重要的生物學標記之一〔2〕。SCG3對神經與精神疾病、神經內分泌腫瘤及其他代謝性疾病的診斷、治療及預后評估具有重要的臨床指導意義〔3，5〕。本研究采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)或1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導小鼠及細胞模擬PD模型，檢測多巴胺能神經元及神經膠質細胞中SCG3的表達分布及變化情況，探討SCG3參與神經細胞毒性反應及其參與PD發病的可能機制。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑 DMEM/F12培養基、DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰酶均購自Gibco公司。MPTP及MPP+均購自Sigma公司。酪氨酸羥化酶(TH)抗體(ab112)、SCG3抗體(ab65821)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(ab7260)、離子鈣接頭蛋白(Iba1)抗體(ab153696)、β-肌動蛋白(Actin)抗體(ab8227)均購自英國 Abcam 公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor488熒光標記山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 555標記驢抗兔IgG均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2細胞培養 神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y及星形膠質瘤細胞U118均購自中科院細胞中心(源自美國ATCC)。在37℃、5% CO2及濕化條件下，用含有10% 胎牛血清的DMEM/F12培養基培養SH-SY5Y細胞，用含有10% 胎牛血清的DMEM高糖培養基培養U118細胞。根據生長狀況，每1～2 d更換培養液。待細胞覆蓋率達80%～90% 時傳代，取處于對數生長期狀態良好的細胞用于實驗并分為控制組和實驗組。

1.3細胞免疫熒光 將細胞接種于含有蓋玻片的35 mm 培養皿中，每皿約5×105個細胞；24 h后，將控制組更換培養液，實驗組加入含3 mmol/L MPP+的培養液，繼續培養24 h。結束培養，以磷酸鹽緩沖液(PBS)/CM〔含1 mmol/L氯化鎂(MgCl2)及0.1 mmol/L氯化鈣(CaCl2)的PBS〕洗滌3次，加入1 ml 3% 的多聚甲醛，室溫固定15 min；加入0.2% Triton X-100，室溫作用10 min；加入含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS/CM室溫封閉30 min；加入SCG3特異性抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜；加入熒光標記抗體(1∶500稀釋)，室溫避光孵育1 h。每次孵育后均用PBS/CM洗滌3次，每次10 min。抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集結果。

1.4動物飼養與造模 實驗選用雄性、8周齡、體重22～24 g的C57BL6小鼠30只(購自包頭醫學院實驗動物中心)，分為對照組與模型組。對照組腹腔注射生理鹽水，模型組腹腔注射MPTP(30 mg/kg體重)，每天1次，連續給藥7 d。給藥結束后繼續飼養21 d，期間通過曠場實驗對小鼠自發行動能力進行檢測。曠場系統為長寬均為50 cm、高40 cm的方形箱子，正式實驗開始前用小鼠調試好系統，將底板擦拭干凈，小鼠背對實驗者輕放入曠場中央，蓋上遮光布，實驗過程中保持弱光照明。記錄小鼠運動總距離以反應小鼠的自發行動能力，5 min后停止攝像。每只小鼠檢測結束后將底板清洗干凈并用酒精擦拭以避免氣味對實驗的影響。

1.5樣品采集與檢測 小鼠取腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h。固定后，制作石蠟切片。免疫組織化學檢測腦組織中多巴胺能神經元、小膠質細胞、星形膠質細胞的分布與表達(選用細胞標記物抗體，標記多巴胺能神經元采用TH抗體1∶1 500稀釋，標記小膠質細胞采用Iba1抗體1∶1 000稀釋，標記星形膠質細胞采用GFAP抗體1∶1 000稀釋)，SCG3蛋白的分布與表達(SCG3抗體1∶1 000稀釋)，組織免疫熒光檢測腦組織SCG3蛋白的分布與表達(SCG3抗體1∶1 000稀釋)，相差或熒光顯微鏡下觀察并采集結果。

1.6統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1小鼠PD模型建立與檢測 與對照組比較，模型組在規定時間內運動距離明顯減少〔n=6，(5 132.63±1 353.62)cm vs (3 830.95±519.14)cm,P<0.05〕,黑質紋狀體多巴胺能神經元密度降低，陽性細胞數量〔n=6，(115.33±10.09)個vs(99.83±8.06)個〕顯著減少(P<0.05)，活化的小膠質細胞及星形膠質細胞明顯增多(n=6，Iba1：1.93±0.70 vs 2.95±0.55；GFAP：1.76±0.47 vs 2.66±0.51;均P<0.05)，見圖1。

2.2小鼠腦及黑質紋狀體SCG3表達與分布 對照組小鼠部分多巴胺能神經元及神經膠質細胞可表達SCG3，模型組小鼠大部分多巴胺能神經元中未檢測到SCG3的表達，而疑似星形膠質細胞中檢測到大量SCG3的表達；模型組SCG3陽性囊泡數量明顯增多(1.23±0.24 vs 2.49±0.43,P<0.05，n=6)，聚集在細胞核周圍(圖2)。

2.3細胞系中SCG3表達與分布 在SH-SY5Y 細胞中SCG3表達豐富，廣泛分布于整個胞質及神經突中，MPP+誘導后，SCG3蛋白表達量顯著下降(控制組：2.51±0.30 vs 實驗組：1.32±0.40,n=6,P<0.05)；在U118 細胞中SCG3主要分布于細胞核周圍，MPP+誘導后，SCG3蛋白表達量顯著增高(控制組：2.04±0.32 vs 實驗組：3.80±0.71，n=6,P<0.05)，細胞核周圍增多尤為顯著(圖3)。

圖2 MPTP對小鼠腦組織SCG3蛋白的影響(全腦×4，黑質紋狀體×40)

圖3 免疫熒光檢測MPP+對SH-SY5Y細胞、 U118細胞 SCG3表達與分布的影響(×40)

3 討 論

PD病因尚不清楚，目前研究認為與年齡老化、遺傳易感性及接觸神經毒素等綜合因素有關〔6,7〕。PD主要病理改變為黑質致密部(SNpc)多巴胺能神經元大量凋亡，殘留的神經元胞質中嗜酸性Lewy包涵小體形成，損傷神經元周圍神經膠質細胞活化。大量神經元凋亡導致多巴胺合成減少，黑質-紋狀體通路多巴胺能與膽堿能神經遞質平衡失調，膽堿能遞質活性相對增高，表現出錐體外系功能亢進的臨床表現。活化的神經膠質細胞表達的功能蛋白、神經營養因子改變并釋放大量炎性因子，導致細胞外微環境紊亂，進一步加劇神經元損傷及神經遞質失衡。神經元與神經膠質細胞(小膠質細胞、星形膠質細胞)的相互通信在PD病變啟動及疾病進程中發揮重要作用〔8,9〕。MPTP及活性形式MPP+是目前被公認的神經毒素，被廣泛應用于PD發病機制及治療等細胞學與動物學的基礎研究〔10〕。

分泌顆粒廣泛分布于神經細胞，是儲存生物活性肽類及胺類的重要細胞器。在分泌顆粒形成過程中，SCG3可作為特異性受體引導分泌粒家族成員CgA、CgB、CgC等與生物活性物質有效聚集，之后通過膽固醇依賴方式結合在膜的類脂質成分上，促進分泌顆粒形成并將生物活性物質包裝于囊泡〔11,12〕。SCG3對生物活性物質的聚集、靶向輸送、分泌顆粒的形成及后續的囊泡內包裝均發揮重要作用。本研究結果推測SCG3可能通過影響多巴胺能神經元及神經膠質細胞中生物活性肽類與胺類的運輸、包裝及分泌顆粒形成從而參與PD發病。

對細胞系的研究發現，生理狀態下SH-SY5Y細胞富含SCG3蛋白，經MPP+誘導后，SCG3蛋白表達下降，SCG3在多巴胺能神經細胞內發揮調節包括多巴胺在內的神經遞質運輸與代謝的生物學功能〔13,14〕，神經毒素影響上述功能，是誘使機體出現PD癥狀的原因之一。在U118 細胞中，經MPP+誘導后SCG3蛋白表達顯著上升，SCG3陽性囊泡數量明顯增多，聚集在核周內質網區域，推測其功能為包裝與運輸活化膠質細胞產生的功能蛋白、神經營養因子、炎性因子等〔5,15,16〕。神經炎癥反應是PD發病的機制之一，活化星形膠質細胞可作為中樞神經系統損傷的病理標記〔17〕，活化后的星形膠質細胞可通過自分泌、旁分泌的方式影響多巴胺能神經元的活性及凋亡，啟動PD發病并加速其病程〔18〕。

綜上，生理狀態下SCG3分布于多巴胺能神經元及神經膠質細胞，毒素誘導后多巴胺能神經元中SCG3下降，星形膠質細胞中SCG3明顯增多。SCG3可能通過運輸、包裝神經細胞內生物活性物質參與PD發病。上述研究結果填補了PD發病機制的基礎數據，并對SCG3的生物學功能作出重要補充。