運動應激對衰老大鼠神經免疫功能及HPA軸皮質酮分泌的影響

劉忠民，呂振磊，高曉新，尹 超

(海南科技職業大學健康科學學院，海南 海口571126)

下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)與神經內分泌免疫、情緒應激、炎性反應密切相關，是機體主要的免疫調控通路[1]。運動實際上是一種強有力的刺激，促進生理和代謝適應，如腦的可塑性和細胞重塑的變化。人體機體當受到外界刺激時，會激活HPA軸，從而促使腎上腺皮質激素的合成和分泌，皮質酮分泌過多會誘發腎上腺腫瘤和提高心血管疾病的發病率，皮質酮分泌過低會導致身體器官功能衰退[2]。研究認為HPA軸在神經免疫網絡發揮重要重用，D-半乳糖衰老建模屬于惡性刺激，惡性刺激會引起神經內分泌紊亂，進而誘發各種疾病，如惡性腫瘤。長期適宜的運動應激屬于良性刺激，其作用機制是多方面的。因此，本研究通過觀察運動應激刺激對衰老大鼠不同腦區5-羥色胺(5-HT)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)及外周血皮質酮的影響，探討HPA軸的神經免疫機制及運動對其干預的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

6周齡SPF級雄性 Sprange-Dawley大鼠 32只(湖南實驗動物有限責任公司提供),體重 350 g-400 g,隨機分為4組：對照組、衰老組、運動組、衰老運動組。大鼠均分籠飼養于海南醫學院動物實驗室，自由飲水與攝食，每隔一天定時清理鼠籠、更換墊料。環境溫度25℃，相對濕度60%-70%，自然晝夜交替。

1.2 D-半乳糖衰老模型及運動方案

(1)本實驗采用D-半乳糖腹腔注射建立衰老氧化應激模型[3]，衰老組大鼠腹腔注射10%的D-半乳糖溶液1 mL/(kg·d)，對照組腹腔注射等體積的生理鹽水,連續8周。(2) 根據BEDFORD 等[4]研究，實驗大鼠進行一周的適應訓練，跑臺坡度設為0，跑臺速度最終達到1.1 km/h,持續運動8周。具體運動應激負荷強度如表1所示。

表1 各運動組大鼠運動應激負荷強度

1.3 取材

實驗干預結束24 h后，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后處死大鼠，采集血清和腦組織。腹腔動脈采血，30 min后離心分離血清(4℃，3 500 r/min離心10 min)，-80℃冰箱保存。取血結束后，仔細并迅速取出大鼠的腦組織。在冷板上立即從大腦將海馬和前額葉皮質分離暫放盛有干冰的保溫箱里，最終用液氮冷凍后儲存在-80℃的冰箱中進行后續的生化分析。

1.4 指標檢測

(1)通過使用硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)測定法估計海馬、皮質MDA丙二醛(MDA)水平(軟件版本：2.09.2檢測速度:正常,延遲:100 msec,測量值/數據點:8 實際溫度:24.5)。(2)細胞因子檢測：海馬、皮質T-SOD、5-羥色胺(5-HT)，大鼠血清皮質酮水平采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA試劑盒,江萊生物)。

1.5 統計分析

2 結果

2.1 長期運動應激對大鼠海馬抗氧化能力的影響

D-半乳糖衰老應激模型組大鼠海馬MDA、T-SOD含量與對照組相比均差異有統計學意義(P<0.01)，衰老運動組與衰老組相比，MDA含量低于衰老組(P<0.05)，衰老運動組T-SOD明顯高于衰老組(P<0.05)，差異具有統計學意義。衰老運動組海馬T-SOD含量高于對照組(P<0.05)，差異具有統計學意義，見表2。

表2 各組大鼠海馬MDA、T-SOD水平(n=8,μmol·g-1)

2.2 長期運動應激對大鼠不同腦區5-羥色胺水平的影響

與對照組相比，衰老組不同腦區5-HT表達均下降P(<0.05)，差異具有統計學意義；運動組5-HT顯著性表達增加(P<0.01)，具有極其顯著性差異；衰老運動組與衰老組相比，海馬和前額葉皮質中5-HT均增加(P<0.05)，差異具有統計學意義，見表3。

表3 各組大鼠海馬、前額葉皮質中5-HT的表達水平(n=8,ng/g)

2.3 長期運動應激對衰老大鼠血清皮質酮的影響

從表4可以看出，與對照組相比，衰老組與運動組血清中皮質酮含量明顯增加(P<0.05)，差異具有統計學意義；衰老運動組與衰老組相比，運動組+衰老組血清中皮質酮明顯增加(P<0.05)，差異具有統計學意義。

表4 各組大鼠血清中皮質酮的含量(μg·L-1)

3 討論

機體長期良性刺激可以抵抗氧化應激對細胞帶來損傷，產生保護性適應，增強神經內分泌功能[5]。劉洪珍等研究發現[6]，進行有氧運動干預組人的海馬中MDA含量較對照組相比，具有極低的水平，安靜狀態下表現出極顯著性差異(P<0.01)；運動應激提高了谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性。國外實驗研究表明，運動應激對情緒和認知的改善可能由于它作用在海馬神經的因素[7]。海馬體在認知、情緒調節、壓力反應、學習、記憶甚至預測未來事件方面發揮著重要作用。本研究結果表明，運動應激可以對大腦的抗氧化系統效力產生積極作用，從而改善認知功能。超氧化物歧化酶(SOD)是參與氧代謝的重要酶，可將超氧自由基轉化為氧氣或過氧化氫[8]。SOD活力高代表這機體清除超氧陰離子自由基能力強。本實驗結果顯示，衰老組海馬中MDA含量顯著性增加(P<0.01)，而T-SOD含量明顯降低(P<0.01)，表明D-半乳糖注射引起的衰老應激脂質過氧化程度高，自由基清除能力減弱，間接證明細胞損傷嚴重。在檢測各組大鼠海馬組織中總超氧化物歧化酶(T-SOD)時發現，衰老組大鼠T-SOD活力明顯要低于對照組;衰老運動組與衰老組相比，T-SOD在衰老運動組表現出較高的水平，這說明長期運動刺激使T-SOD酶活性顯著提高。實驗表明長期運動刺激能夠減少MDA的產生，增強T-SOD的含量，減少神經細胞損傷。

5-HT是一種能產生愉悅情緒的信使，幾乎影響到大腦活動的每一個方面，從調節情緒、精力、記憶力到生命觀均有涉及。以前的研究更多地關注5-HT在中樞神經系統(CNS)中的作用。然而，5-HT也與腫瘤，炎癥和病原體感染的病理病例有很強的關系[9]。5-HT參與腫瘤細胞遷移，轉移擴散和血管生成[9]。下丘腦與神經垂體與腺垂體的聯系是神經內分泌系統的關鍵。達娜·沃爾夫等[10]人進行了單劑量選擇性5-HT再攝取抑制劑(艾司西酞普蘭)對虛擬暴力期間情緒調節的研究，結果顯示，暴力背景下的情緒調節由5-HT調節。不同情緒應激反應直接影響5-HT的表達。本次實驗結果顯示衰老組大鼠海馬和前額葉皮質區5-HT含量均明顯降低(P<0.01)，實驗結果表明惡性刺激(D半乳糖注射)可能通過使HPA軸紊亂，進而導致大鼠5-HT含量降低，導致衰老加劇。運動組兩個腦區5-HT含量明顯增加(P<0.01)，說明長期的良性應激能夠保持HPA軸平衡，增加有益激素的分泌，對機體進行調控。對照組中5-HT水平較低，但通過運動應激明顯增加了大鼠不同腦區5-HT水平，結果表明在改善不同腦區氧化應激水平中，運動應激起到了重要的作用。

生理和心理壓力導致皮質酮增加的主要機制與下丘腦-垂體-腎上腺通路的活性有關。國外研究表明，運動員的皮質醇濃度低于運動前久坐的個體。皮質酮的降低可能是通過調節下丘腦-垂體-腎上腺通路和負反饋系統的活性或降低TNF-a水平、炎癥和氧化應激標志物以及增加SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶的抗氧化活性來誘導的(GPx)，神經營養表達[11]。衰老會使皮質酮水平增加[12-14]，本實驗結果表明也衰老組大鼠皮質酮水平明顯增加(P<0.05)。運動應激即刻會增加血清中皮質酮水平，但恢復后低于運動前靜息水平。研究表明[15]，在強迫游泳或熱應激期間，皮質醇在3分鐘內增加到最高水平，40分鐘達到最大值，證實了在不同應激條件下血清中皮質酮的變化。運動刺激皮質酮增加的主要機制在于下丘腦刺激促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)的產生，進而刺激垂體中的促腎上腺皮質激素(ACTH)。ACTH刺激腎上腺釋放皮質醇激素(嚙齒動物中稱為皮質酮)[16]。通常，當壓力源或對器官的威脅停止時，一個綜合的負反饋回路系統會停止皮質醇的產生，但長期暴露于壓力源會導致皮質醇的持續產生，從而導致紊亂。通過本實驗研究表明，運動應激改善HPA軸平衡很可能由于刺激皮質酮負反饋回路系統，改善負反饋回路系統的抗應激作用，從而改善神經退化，增加海馬體積，減少炎癥，進而與運動刺激的其他通路協同增強中樞神經免疫系統。

綜上，本研究通過長期運動應激對衰老大鼠神經免疫功能及HPA軸皮質酮分泌的動物實驗可得出：良性刺激(長期運動干預)能夠減少實驗大鼠大腦細胞脂質過氧化作用，增加清除超氧陰離子自由基能力，減少神經細胞損傷；同時能夠通過增加兩個腦區5-HT含量，維持下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的平衡，長期運動刺激能夠增加血清中皮質酮水平；惡性刺激(D-半乳糖注射)增加神經細胞的氧化應激，擾亂了下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的平衡，破壞機體內環境，加速大鼠衰老的形成。運動組大鼠腦區T-SOD明顯高于衰老組，表明長期的良性刺激可增強神經抗氧化能力，減少大鼠神經免疫功能的損害，從而維持機體免疫穩態，預防腫瘤等疾病的發生。