2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

趙 燕 譚 洪 李會芳 呂瓊花 杜思成 楊秋萍▲

1.昆明醫科大學第一附屬醫院糖尿病科，云南昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院老年醫學科，云南昆明 650032

隨著物質生活的不斷改善，糖尿病已成為影響人類健康的主要疾病之一，其發展趨勢每年都在增加，已成為全球公共衛生問題。根據國際糖尿病聯合會（International Diabetes Federation，IDF），到2025年，全世界將有大約3 億人患糖尿病，糖尿病是一種慢性疾病，治療周期長，而亞洲是迅速出現的2 型糖尿病（type 2 diabetic mellitus，T2DM）全球流行病的主要地區。2015—2017年對慢性病和風險因素的監測顯示，18 歲及以上人口中糖尿病的發病率由2013年的10.4%上升至11.2%。且肥胖、超重人群患病率顯著增加，肥胖人群糖尿病患病率升高了2 倍，體重指數≥30 者患病率為21.2%。非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和T2DM 的發病風險因素較高，NAFLD 與代謝綜合征的成具有雙重關聯，它增加了T2DM 及其并發癥的發生風險，肥胖和糖代謝異常使NAFLD 患者的肝病死亡率增加了10 倍。因此，為2 型糖尿病大鼠建立NAFLD 模型對于結合NAFLD 深入研究T2DM 非常重要。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

昆明種健康雄性SD 大鼠40 只，由昆明醫科大學動物實驗中心提供，6～8 周齡，體重（200±24）g，SPF級，動物生產許可證號：SCXK 滇2011-0004，自由供應食物和飲用水。本研究經昆明醫科大學動物實驗倫理委員會審核通過。

1.2 飼料及試劑

普通飼料：由玉米粉、小麥粉、豆粉、魚粉、鼓皮巧、骨粉等充分混合、壓制成型、喂養（由昆明醫科大學動物實驗中心提供加工）。基礎飼料的總熱量為13.85 kJ，其中蛋白質占23%、碳水化合物占50%、脂肪占5%，其他占22%。自制高糖高脂飼料：10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇、1%膽酸鈉、67%普通飼料（參照Guo 等的配方），由專業的人員加工生產，各種配料經過充分攪拌、壓制和成型后，再進行喂養，每周臨時配制。試劑：鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自calbiochem 公司。

1.3 STZ 液配置

將STZ 300 mg 溶于30 ml 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mmol/L，pH=4.3）中配制成STZ 液（濃度：10 mg/ml），現場配制，盡量避光，并在15 min 內使用。

1.4 模型的建立和分組

40 只SD 大鼠，適應性喂養1 周后按隨機數字表法分為糖尿病（diabetes mellitus，DM）組和正常對照（normal control，NC）組，每組各20 只。NC 組給予普通飼料喂養5 周后禁食12 h，DM 組一次性左下腹腔注射STZ 35 mg/kg。STZ 腹腔注射后72 h 測大鼠隨機血糖≥16.7 mmol/L（尾靜脈血）為造模成功。DM 組共13只造模成功，另從NC 組中選取13 只進行數據統計，繼續喂養4 周，每周記錄其體重、血糖，喂養過程中DM 組死亡4 只。

1.5 觀察指標及評價標準

1.5.1 生化指標檢測 腹膜內注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，從心房取血，以3500 r/min 離心15 min，離心半徑為20 cm，取血清并置于無菌的電生理試管中并標記。OlympasAU2700 全自動生化分析儀檢測三酰甘油（triacylglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）。

1.5.2 胰島素抵抗指數 酶聯免疫吸附法用于檢測空腹胰島素（fasting insulin，FINS）。通過穩態模式評估胰島素抵抗指數（Homeostasismodel assessment insulin resistance index，HOMA-IR）=FINS×空腹血糖（fasting blood glucose，FPG）/22.5。胰島 素敏感 指數（insulin sensitivity index，ISI）=1/（FINS×FPG）。

1.5.3 肝臟標本留取 大鼠麻醉取血后解剖取肝臟，天平稱重，計算肝指數=肝重/體重×100%。部分放入10%福爾馬林固定石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察。

1.5.4 HE 染色NAS 積分結果判斷 每張切片隨機選取5 個視野，進行圖像的采集。NAFLD 活動的常規積分是根據NAFLD 診斷和治療手冊（修訂本）中規定的組織學診斷標準進行的（表1）。非酒精性脂肪肝病活動度積分（non-alcoholic fatty liver disease srore，NAS）＜3 分可排除非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），NAS ＞4 分則可診 斷NASH，NAS 3～4 分為NASH 可能。

表1 NAS 積分（分）

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 兩組大鼠造模成功后血糖及體重的比較

造模成功6、7、8、9、10 周后，DM 組的體重低于NC 組，血糖高于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2～3）。

表2 兩組大鼠造模成功后血糖的比較（mmol/L，±s）

表3 兩組大鼠造模成功后體重的比較（g，±s）

2.2 兩組大鼠血脂及肝指數的比較

DM 組的TG、TC、ALT、肝指數高于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組的AST 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

表4 兩組大鼠血脂及肝指數的比較（±s）

2.3 兩組大鼠造模成功6、10 周后FINS、ISI、HOMA-IR的比較

造模成功6、10 周后，DM 組的FINS、HOMA-IR高于NC 組，ISI 低于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表5）。

表5 兩組大鼠造模成功6、10 周后FIS、ISI、HOMA-IR 的比較（±s）

2.4 兩組大鼠肝組織切片HE 染色結果及NAS 積分的比較

NC 組大鼠肝小葉形態規則，肝細胞排列整齊中央細胞核大而圓，細胞質均勻，無脂肪變性和炎癥細胞侵襲。DM 組大鼠肝細胞水腫、脂肪變性、肝細胞分布不規則、炎性細胞浸潤、局部點狀、壞死。DM 大鼠的NAS 積分為（4.29±0.95）分，高于NC 組的（0.92±0.64）分且＞4 分，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖1，封三）。

圖1 肝組織HE 染色（400×）（見內文第50頁）

3 討論

NAFLD 包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細胞癌。是代謝性應激性肝損害，與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和遺傳易感性密切相關。有報道顯示全球普通成人NAFLD 患病率為6.3%～45%（中位數25.2%），包括中國在內的亞洲多數國家NAFLD 患病率處于中上水平（＞25%）。T2DM與NAFLD 關系密切，世界上最常見的慢性肝病是NAFLD。研究表明DM 與肝纖維化評分間有顯著相關性。近年來，T2DM 的發病率一直在上升，因此構建T2DM 大鼠NAFLD 模型對NAFLD 早期診治的進一步研究有重要意義。

目前主要有自發性動物模型、動物遺傳模型和動物實驗模型方法為T2DM 建立NAFLD 模型。然而，前兩種方法在科學研究中沒有得到廣泛應用，原因是成本高、喂養和繁殖條件高、周期長等。本研究大鼠用10%豬油、20%蔗糖等制作的高糖高脂飲食喂養5 周后，腹膜注射小劑量的STZ（35 mg/kg），以建立T2DM的NAFLD 模型。DM 組SD 大鼠的血糖水平顯著提高（＞16.7 mmol/L），并逐漸出現“三多”（多尿、多食、多飲）癥狀和體重減輕。血糖、血脂、ALT 升高，提示造模成功且出現血脂、肝功能異常。本研究結果顯示，造模成功6、10 周后，DM 組大鼠的FIS、HOMA-IR 高于NC 組，ISI 低于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），與T2DM 合并NAFLD 的臨床特征一致。胰島素抵抗既是T2DM 的發病機制，也是NAFLD 的主要發病機制，T2DM 和NAFLD 在發病機制上存在“共同土壤”，且T2DM 是NAFLD 患者疾病進展的危險因素。國內外指南均指出需高度警惕T2DM 患者可能存在NAFLD 和NASH。并且在治療中也提出不管患者有無T2DM，胰島素增敏劑吡咯列酮都可以用來治療肝活檢證實的NASH 患者。

本研究建立的T2DM 合并NAFLD 模型具有胰島素抵抗及血脂、肝功能異常。肝組織HE 染色光鏡下觀察可見DM 組大鼠肝細胞破壞，細胞位置不規則，有脂肪變性和炎癥細胞浸潤，部分見點狀、局部壞死；NS 組大鼠肝葉形態規律，細胞排列整齊，細胞質均勻，無脂肪變性和炎癥細胞侵襲。本研究結果還顯示，DM 組的NAS 積分高于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示T2DM 大鼠已經有脂肪肝或脂肪肝炎的病理特征。

綜上所述，本研究采用高糖高脂飼料喂養大鼠5 周聯合小劑量STZ 腹腔內注射能成功誘導建立T2DM 合并NAFLD 大鼠模型，為T2DM 合并NAFLD進一步研究奠定基礎。