夏枯草三萜類提取物聯合Survivin-siRNA對食管癌Eca-109細胞抑制作用研究

鄭學芝 徐秋玲 郭 冉 孫 健 王文婷

牡丹江醫學院生理學教研室，黑龍江牡丹江 157011

中藥夏枯草具有散結、明目、清火、消腫、抗腫瘤等作用，所含化學成分包括三萜類（熊果酸、齊墩果酸）、黃酮類、香豆素類、有機酸類、糖類、揮發油類等。其中夏枯草提取物的抗腫瘤作用表現在抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡、誘導分化、逆轉腫瘤耐藥、抑制新生血管生成、抗突變等多方面。但傳統中藥抗腫瘤具有藥物生物利用度低、起效慢、療程長等特點，影響了其在臨床上的應用。因此需要探究能增強夏枯草抗腫瘤療效的方法。食管癌是嚴重危害人類健康的消化系統惡性腫瘤之一，其發生發展與多基因表達異常有關，所以研究致癌相關基因并加以干預具有重要意義。Survivin 基因在多種腫瘤的發生發展中發揮作用，參與調控細胞凋亡和細胞周期，是最強的凋亡抑制因子之一，下調Survivin 基因表達可以促進腫瘤細胞的凋亡，Survivin 基因參與調控食管癌ERK 信號傳導通路，Survivin 蛋白表達與食管癌分化程度和TNM 分期有關，故推測Survivin 基因可能對食管癌細胞的惡性增殖發揮重要作用。但臨床實踐表明，單獨干預一個基因不能起到穩定持久的抗癌效果。所以本研究設計將中藥夏枯草三萜類提取物與Survivin基因靶點干預聯合應用，探究從調控基因表達角度，能否起到優化夏枯草抗食管癌療效的作用及可能性，觀察中藥夏枯草三萜類提取物聯合Survivin-siRNA對食管癌Eca-109 細胞增殖抑制、凋亡誘導作用的影響，研究兩種治療方法對食管癌Eca-109 細胞是否具有協同抑制作用，Survivin-siRNA 能否增強夏枯草的抗腫瘤敏感性，進一步探究夏枯草抗食管癌機制，為臨床食管癌中醫藥治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

食管癌Eca-109 細胞：購自原中科院上海細胞所，傳代培養后由牡丹江醫學院科研中心保存；夏枯草三萜類提取物：利用大孔樹脂法得到三萜類成分，用95%乙醇溶解，配成生藥濃度為100 mg/ml 的夏枯草提取液，夏枯草購自廣東匯群中藥飲片公司（貨號：粵20160301）；RPMI1640 培養基（貨號：22400-0089）、胎牛血清（貨號：10270-106）、胰蛋白酶（貨號：25200-056）：購自Gibco 公司；RT-PCR 試劑盒（貨號：RR037A）：購自takara 公司；Trizol（貨號：R0016）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0011）、Survivin 抗體（貨號：AS792）、GAPDH 抗體（貨號：AF1186）：購自碧云天生物技術研究所；Survivin-siRNA B 套餐（貨號：A10002）、siRNA-Mate 轉染試劑（貨號：G04003）：購自Gene Pharma 公司；Annexin-V-FITC/PI 凋亡雙染試劑盒（貨號：556547）：購自BD 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（貨號：BA1056）、CCK-8 試劑盒（貨號：AR1160）：購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 細胞培養

食管癌Eca-109 細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基中，于37℃、5%CO飽和濕度的培養箱內培養，2～3 d 傳代一次，選取處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 Survivin-siRNA 的選用及設計

參考文獻[12]及Gen Bank 中人類Survivin 基因序列，設計靶向人Survivin 基因的特異性siRNA 序列為：正向5-′GGCUGGCUUCAUCCACUGCTT-3′，反向5′-GCAGU-GGAUGAAGCCAGCCTT-3′；無意義siRNA序列為：正向5-′CAGUCGCGUUUGCGACUGGTT-3′，反向5′-CCAGUCGCAA ACGCGACUGTT-3′。

1.4 實驗分組

空白對照組：食管癌Eca-109 細胞常規培養，不進行任何處理；陰性對照組：食管癌Eca-109 細胞轉染無意義siRNA；夏枯草單獨處理組：夏枯草三萜類提取物處理食管癌Eca-109 細胞；siRNA 轉染單獨處理組：食管癌Eca-109 細胞轉染Survivin-siRNA；夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組：食管癌Eca-109 細胞轉染Survivin-siRNA 24 h 后入夏枯草三萜類提取物。調整夏枯草三萜類提取物終濃度為168 μg/ml。

1.5 Survivin mRNA 表達檢測

轉染前24 h 將食管癌Eca-109 細胞以2×10/孔接種至6 孔板上，待胞增殖達到30%～50%密度時，按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組相應細胞轉染。轉染后24 h，夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組加入夏枯草三萜類提取物，之后所有組細胞繼續培養48 h 后進行指標檢測。收集各組食管癌Eca-109 細胞，利用Trizol 試劑一步法提取總RNA。按照RT-PCR 試劑盒說明書進行反轉錄及擴增。以GAPDH 作為內參照，設計Survivin、GAPDH引物序列如下。Survivin 基因產物約363 bp，正向引物P1：5′-AGCCCTTTCTCAACGACCAC-3′，反向引物P2：5′-GCACTTTCTTCGAGTTTCC-3′；內參照GAPDH 基因產物長度約280 bp，正向引物P3：5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA-3′，反向引物P4：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3′。PCR 反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 次循環；72℃延伸10 min。擴增反應結束后將產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像分析系統分析Survivin 基因表達情況。

1.6 Survivin 蛋白表達檢測

收集各組食管癌Eca-109 細胞，加入RIPA 裂解緩沖液，提取總蛋白，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。采用12%SDS-PAGE 電泳分離后進行轉膜、封閉，Survivin 抗體（1∶1000）、GAPDH 抗體（1∶1000）室溫孵育過夜，TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（1∶1000）二抗室溫孵育2 h，暗室中ECL 反應后曝光顯影，用quantity one 4.6.2 軟件進行分析。

1.7 CCK-8 法檢測細胞增殖抑制率

在96 孔培養板上按照5×10/孔接種各組食管癌細胞，每組各接種3 孔。待細胞增殖達到30%～50%密度時，按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組細胞轉染。細胞轉染后24 h，夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組加入夏枯草三萜類提取物，繼續培養48 h 后，向所有組細胞待測孔內各加入CCK-8 試劑10 μl，培養箱孵育4 h 后于450 nm 處用酶標儀測定各孔的吸光度（optical density，OD 值）。以培養液做空白對照并調零，測3 次，取平均值。細胞增殖抑制率=1-細胞存活率，即細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD 值/空白對照組OD 值）×100%。

1.8 細胞凋亡檢測

在6 孔板上按2×10接種各組食管癌細胞，待細胞增殖達到30%～50%密度時，按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組相應細胞轉染。轉染后24 h，夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組加入夏枯草三萜類提取物，繼續培養48 h 后，取各組腫瘤細胞1×10個，加入Annexin-V-FITC 4 μl，PI 5 μl，Annexin-V 結合緩沖液400 μl，室溫條件下避光作用15 min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 Survivin mRNA 表達檢測

夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA 表達水平均低于空白對照組與陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA表達水平低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組食管癌細胞中Survivin mRNA 的表達情況

2.2 Survivin 蛋白表達檢測

夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin 蛋白表達水平均低于空白對照組與陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin 蛋白表達水平低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2、表1）。

圖2 各組食管癌細胞中Survivin 蛋白的表達情況

表1 各組食管癌細胞中Survivin 蛋白表達水平的比較（±s）

2.3 細胞增殖抑制率檢測

夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率高于空白對照組與陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 各組食管癌細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

2.4 細胞凋亡檢測

流式雙染結果顯示，夏枯草單獨處理組、siRNA轉染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞凋亡率高于空白對照組與陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞凋亡率高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3、表3）。

圖3 各組食管癌細胞凋亡率

表3 各組食管癌細胞凋亡率（%，±s）

3 討論

食管癌發病率在全世界范圍內居高不下，隨著現代外科醫學高速發展，手術輔助以放化療的治療方式使食管癌患者的5年生存率得到了改善，但還存在術后腫瘤轉移、復發及因手術創傷、放化療副作用等因素造成患者的生活質量降低等問題，因此中醫藥治療、靶向基因干預等非手術治療方法已成為食管癌防治研究的熱點。與傳統化療藥物相比，夏枯草毒副作用小，不易產生耐藥，患者主觀接受度高，但是夏枯草成分復雜，抗腫瘤作用起效慢，療程長，生物利用度低，限制了其在臨床上的應用。因此，有必要通過聯合其他抗腫瘤策略以利于夏枯草提取物抗食管癌的臨床應用及推廣。

食管癌的發生與促凋亡基因和抗凋亡基因的失衡有關，其中Survivin 基因對食管癌增殖和凋亡的影響尤其顯著。Survivin 基因在胚胎組織、多種惡性腫瘤組織中廣泛表達，具有調節細胞周期、抑制細胞凋亡、調控腫瘤血管生成等作用。研究表明，Survivin在腫瘤組織高表達不僅與腫瘤發生有關，而且與腫瘤的淋巴轉移、生存期和復發有關，抑制Survivin 基因表達能起到抑制腫瘤的作用。

基于以上原因，本研究探討Survivin-siRNA 能否增強中藥夏枯草三萜類提取物對食管癌Eca-109 細胞增殖抑制、凋亡誘導作用，從基因表達層面探究夏枯草抗食管癌作用機制。本研究結果顯示，夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA及Survivin 蛋白表達水平均低于空白對照組與陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均高于空白對照組與陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA 及Survivin 蛋白表達水平均低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉染聯合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉染單獨處理組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示Survivin 基因沉默與夏枯草三萜類提取物對食管癌Eca-109 細胞具有協同抑制效應，Survivin 基因沉默增加了夏枯草三萜類提取物抑制食管癌細胞增殖敏感性。夏枯草三萜類提取物聯合Survivin-siRNA 從理論上有望為臨床食管癌中藥及靶向治療提供新的思路和方案。推測夏枯草抗食管癌作用與抑制Survivin 基因表達密切相關，具體機制有待于進一步研究。

目前，有關Survivin-siRNA 聯合中藥夏枯草在食管癌治療中的研究較少，本研究只觀察了離體情況下中藥夏枯草三萜類提取物聯合Survivin-siRNA 對食管癌Eca-109 細胞的增殖抑制、凋亡誘導作用，今后尚需通過體內動物實驗進一步驗證以Survivin 作為基因靶點聯合夏枯草提取物對在體食管癌的影響，以及二者聯合應用作為治療食管癌策略的有效性及可行性，為夏枯草的抗腫瘤臨床應用奠定實驗基礎。