溫敏型水凝膠包載布比卡因對延長神經阻滯時間的研究

郭 穎，郭 傲，路 暢，劉國梁，周升柱，王吉蘋，石宏宇，劉鐵成*

(1.吉林大學第二醫院 麻醉科，吉林 長春130041；2.吉林大學第一醫院 內鏡中心，吉林 長春130021)

外科手術常常通過應用局部麻醉藥阻斷手術部位的神經傳導從而達到鎮痛的效果。理想的局麻藥應該在具有良好的鎮痛效果的同時沒有局部刺激作用，致敏程度低，較高的治療指數以及感覺阻滯遠大于運動阻滯等特點，然而同時具備上述特征的理想藥物是不存在的[1]。

水凝膠是一種通過物理或者化學交聯的、遇水膨脹的三維立體網絡結構。環境敏感水凝膠可以對類似于溫度、pH、酶促反應等做出反應的智能水凝膠。我們最常用的包載局麻藥的水凝膠為溫度敏感型水凝膠，絕大多數的溫敏型水凝膠在室溫下為液體狀態，在更高的溫度下(譬如體溫)即可轉變為膠體狀態[2]。為了延長單次注射局部麻醉藥制劑所產生的作用時間，將臨床上常見水溶性局麻藥包載于可注射的、生物可降解的、溫度敏感性的水凝膠中，研究坐骨神經阻滯延長的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

Pluronic F127(Sigma-Aldrich 上海貿易有限公司)；PAla-PEG-PAla(中科院生態環境高分子材料重點實驗室)；PLGA-PEG-PLGA(長春圣博瑪生物材料有限公司)；鹽酸布比卡因(北京華奉聯博科技有限公司)；彈性蛋白酶(Merck公司，德國，達姆施塔特)

1.2 實驗方法

1.2.1載藥水凝膠的制備 將臨床常用的鹽酸布比卡因(bupivacaine hydrochloride，BUP)堿化沉淀制成疏水制劑(布比卡因游離堿,bupivacaine free base，BFB)，并包載于水凝膠中。

1.2.2實驗動物 從吉林大學實驗動物中心購買20只體重介于260 g-320 g之間的年輕成年雄性Wistar大鼠。所有的動物實驗均符合吉林大學動物保健和使用委員會批準的協議。動物被單獨安置在自然光明/黑暗條件下的塑料籠子里，供應充足的食物和水。實驗前預適應環境至少2周。

1.2.3大鼠坐骨神經阻滯 大鼠隨機分為4組，每組5只大鼠，乙醚吸入麻醉后行坐骨神經阻滯術，分別給予：1)0.75 wt.% BUP·HCl溶液PBS(對照組)；2)0.75 wt.% BFB Pluronic F127水凝膠，稱為Pluronic F127/BFB；3)0.75 wt.% BFB PAla-PEG-PAla水凝膠,PAla-PEG-PAla/BFB；4)0.75 wt.% BFBPLGA-PEG-PLGA水凝膠，標記為PLGA-PEG-PLGA/BFB。每只大鼠給予0.6 ml的藥物制劑。

1.3 神經狀態評估

1.3.1通過改良后的熱盤試驗對痛覺阻滯的有效性進行評估[3]熱盤的溫度設定在可以提供一個8-10 s左右的供被測試大鼠抬腿的反應時間，溫度的準確性通過利用溫度計來保證。被測試大鼠的后足被依次放置在熱板上(先右再左)，應用秒表記錄老鼠的肢體抬足反射或導致動物舔爪子的時間，即反應時間。為了避免在測試過程中發展為痛覺過敏或熱損傷,我們設定30 s為截止時間。在給藥前2天獲得每只大鼠自身的熱反應測量基線。給藥后，在所選擇設定的每一個時間點，每只大鼠都將測試一式3份，取平均值為熱延遲時間。為了方便組間比較,我們把數據轉化為最大比例效應(MPE%)使用以下方程：MPE%=[(P-B)/(C-B)]×100%。其中，P是平均基線反應時間，B為平均治療反應時間，C是截止時間。

1.3.2運動阻滯評估具體評分標準[3]1分代表正常外觀；2分表示當抬起大鼠尾巴時足背屈及腳趾完全張開；3分表示足跖屈且沒有能力展開腳趾；4分表示完全喪失的背屈、跖屈的能力，及伴有步態障礙。為了比較，運動阻滯的持續時間從4分-2分，2分起開始復蘇。

1.3.3坐骨神經周圍組織大體解剖學和形態學大鼠在給藥后第7天予以處死、解剖。收集注射水凝膠臨近的坐骨神經，以及周圍的肌肉組織。坐骨神經和肌肉標本用石蠟固定,HE染色。在大體解剖下，主要觀察局部組織層次是否可以輕易分開，以及局部是否有顯著粘連和疤痕形成。在顯微鏡下，局部的組織壞死以及是否有炎癥細胞(包括中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞)浸潤均被納入觀察評估的標準[4]。

1.4 統計學方法

所有的數據描述均為平均值±標準偏差(SD)。三組水凝膠載藥與對照組(BUP·HCl組)之間的組間差異分析均利用SPSS(Version 18.0，IBM Corporation,Armonk,New York)軟件進行F檢驗。以P<0.05、P<0.01為差異有統計學意義[5]。

2 結果

將局部麻醉藥物封裝在水凝膠結構可以有效延長單次注射后鎮痛持續時間。水凝膠在體內的存留時間是影響藥物釋放的重要因素。BUP·HCl組在注射給藥后5 h即恢復完整的感覺功能(圖1)。通過分析測定的MPE%值可以看出，Pluronic F127/BFB組(0± 100%)和PAla-PEG-PAla/BFB組(93.76%±3.96%)在5 h時與對照組(BUP·HCl組)(73.62%±8.63%)相比較組間差異具有統計學意義。在6 h，BUP·HCl組(0.01%±2.26%)和Pluronic F127/BFB(84.51%±6.85%)或PAla-PEG-PAla/BFB(51.93%±7.43%)之間的統計學意義更加顯著。然而，PLGA-PEG-PLGA/BFB組在任何時間點與BUP·HCl組相比均未體現出明顯的統計學差異。同樣，所有大鼠在給藥后即可觀察到完全的運動阻滯。每隔1 h，對組間運動阻滯的評分進行分析和比較。如圖2所示，當相比BUP·HCl組(2.8±0.45，1.4±0.55，1±0，1±0)，PAla-PEG-PAla/BFB的(3.8±0.45，3.2±0.58，2.8±0.58，2.4±0.58)組從3 h-6 h運動阻滯評分均顯示出具有統計學意義的顯著差異。PluronicF127/BFB組(2.6±0.55，2.6±0.55，1.8±0.45)在4 h-6 h之間與對照組相比下具有明顯統計學差異。PLGA-PEG-PLGA組(2.5±0.58)在4 h時與對照組有顯著性差異。運動阻滯持續時間的中位數PAla-PEG-PAla/BFB(9 h)幾乎為BUP·HCl(5 h)的2倍，雖然僅略長于PluronicF127/BFB組(8 h)。BUP·HCl組的運動阻滯時間只持續了4 h，然后迅速恢復至基線,我們推測可能的原因是藥物的再分配和/或消除作用。運動功能比痛覺功能更快恢復(圖2)。在感覺和運動阻滯測試后，所有的動物完全恢復，沒有觀察到殘留的感覺或運動障礙。

圖1 注射載藥水凝膠后大鼠熱盤實驗中的MPE

圖2 注射載藥水凝膠的大鼠在不同時間點的運動阻滯評分

所有大鼠均未觀察到明顯的神經毒性，但包載有水凝膠的組別局部肌肉組織炎癥反應明顯。相于比BUP·HCl組，PluronicF127組炎性細胞浸潤更明顯。BUP·HCl組沒有觀察到明顯的組織學異常。PAla-PEG-PAla/BFB和PLGA-PEG-PLGA/BFB組炎癥反應尤為明顯，我們可以觀察到明顯的成纖維細胞的增生，局部組織的壞死，以及骨骼肌間炎癥細胞的廣泛浸潤。

3 討論

坐骨神經阻滯的評估主要從大鼠對疼痛的反應以及運動功能方面的影響[5]。所有動物注射包載有BFB的水凝膠后10 min即表現出完整的運動及感覺阻滯，也就是說，局麻藥的起效時間并未受控制釋放的影響。感覺復蘇的順序(由早到晚)為BUP·HCl>PLGA-PEG-PLGA/BFB>PAla-PEG-PAla/BFB>Pluronic F127/BFB。在熱盤試驗中不同組間所體現出的痛覺延遲的差異取決于水凝膠降解時間。水凝膠較長的降解時間似乎提供了一個藥物釋放曲線以及更長的局部麻醉持續時間。然而，給予PLGA-PEG-PLGA/BFB治療組與對照組BUP·HCl相比運動和感覺阻滯方面均未體現出明顯的統計學差異。

比較圖1和圖2，運動機能比痛覺功能更快恢復，這與之前的研究相符合[6]。盡管所有神經纖維均受局部麻醉劑的作用，神經軸突的痛覺傳遞在較低的局麻藥濃度下即可受到影響。根據臨床觀察及現有的一些研究顯示，軸突的直徑和大小仍然是影響傳導速度的重要因素[7]。傳導速度較慢的、細小的感覺神經軸突(A-δ有髓和C-無髓鞘的纖維)比快傳導的，粗大的運動神經軸突(A-α有髓纖維)對于局部麻醉藥顯示出的更強的敏感性。本研究中描述的控釋水凝膠配方可能通過藥物的緩慢低濃度釋放,延遲痛覺恢復[6]。

PAla-PEG-PAla和PLGA-PEG-PLGA均為PEG為基鏈的三嵌段聚合物，均已經通過美國FDA(食品及藥物管理局)藥理應用程序[8]。PAla-PEG-PAla合成同源聚-氨基酸復合物,這是類似于自然產生的蛋白質。而通常認為水凝膠PluronicF127的成膠過程是從凝膠溶液的單聚體平衡狀態向膠束形成的平衡狀態，膠束中存在大量游離水,導致PluronicF127僅體內存留很短的時間。即PluronicF127凝膠降解并通過表面侵蝕，另外2個水凝膠通過上述機制降解[7]。在我們的研究中使用所有的水凝膠均顯示了良好的持久性、強度以及一定的黏度，這些屬性使局部麻醉劑的整合得以實施并已經證明能夠進一步延長釋放期。因此，藥物可能在膠束形成過程中均勻包裹于可溶性聚合物，從而可以控制藥物從凝膠聚合物中釋放的模式[9]。

在組織學檢查過程中，PAla-PEG-PAla/BFB組可以觀察到明顯的局部充血和以及廣泛的膠原增生。炎癥反應的嚴重程度似乎與凝膠在體內的存留時間成正比。PLGA-PEG-PLGA在體內的存留時間遠超過其對于神經阻滯效果的延長，局部組織的炎癥反應使其并非局部麻醉藥載體最佳選擇。具有較短體內降解時間的水凝膠能夠更好的兼顧藥效作用時間延長與局部組織炎癥反應的最小化。即選擇體內降解時間與藥物藥效時間相接近生物材料載體能夠最大程度的提高療效,減少副作用。