PP2A的A/C亞基與多囊蛋白1抑制細胞增殖關系初步探討

萬燁東，楊慧欣，郝書弘，胡春梅，唐 艷*

(1.吉林大學第二醫院 腫瘤血液科，吉林 長春130041；2.吉林大學第二醫院 乳腺外科)

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一種以多發囊腫形成為特征的遺傳性腎病，主要是由編碼多囊蛋白1(polycystin-1，PC1)和多囊蛋白2(polycystin-1，PC2)的PKD1和PKD2基因突變所致，其中，PKD1基因所致的ADPKD占該病譜系的85% 左右[1]。PC1是一種分子量較大的跨膜糖蛋白，包含基質相互作用的胞外大N端和激活G蛋白并與伴侶蛋白相互作用的胞內C端，并通過mTOR、MAPK、cAMP、JAK-STAT、Wnt等多種信號途徑調節細胞轉導[2]。

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶家族中的一員，是由結構亞基PP2A-A(也稱為PPP2R1A)、調節亞基PP2A-C(也稱為PPP2CA)和催化亞基PP2Ab(包含B56α)組成的異源三聚體復合物[3]，它是一種多功能酶，在細胞周期調控，形態以及發育中發揮作用。同時它又在信號轉導的級聯反應中與其他磷酸化酶和激酶相互作用，構成調節大分子從而調控下游信號轉導[4]。

在PC1調節的細胞增殖中，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通過磷酸化其下游靶蛋白來促進蛋白質合成(細胞增殖)，調節下游蛋白質翻譯。因S6 和 4EBP1是mTOR的底物，而PP2A通過使4EBP1 和 p70S6K去磷酸化調節翻譯的起始，提示PP2A是mTOR調節其下游效應器的主要磷酸酶[5]。在最近的研究中，我們發現PC-1通過磷酸酶PP2A/B56α途徑抑制細胞增殖[3]，但對于PP2A的A/C亞基是否參與PC1介導的增殖抑制作用尚未進一步明確。在本研究中，我們初步探討了PC1抑制細胞增殖與PP2A的A及C亞基的關系，從而進一步完善PC-1經磷酸酶PP2A/B56α抑制細胞增殖的研究。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒和試劑

人HEK293T細胞、空白對照質粒pEGFP和PC1基因重組質粒pEGFP-PC1-5TMC均來自Xing-Zhen Chen博士實驗室。HEK293T細胞被置于含DMEM培養液的6孔板中孵育，并在該培養基中加入了L-谷氨酰胺，青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清，環境溫度保持在37℃，CO2濃度為5%。B56α抗體、PP2A-A抗體、PP2A-C抗體為Cell Signaling Technology 公司產品，PP2A-A,PP2A-C,PP2A-B56α的siRNA，小鼠單克隆抗HSP60(H-1)抗體及二抗購自美國圣克魯斯生物技術公司。綠色熒光蛋白(GFP)單抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自鼎國生物公司，用于對GFP標記后的轉染細胞進行免疫印跡驗證。Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。用于細胞培養的DMEM培養液及胎牛血清購自長春尚寶生物公司。化學發光試劑盒購自美國Bio-Red公司。

1.2 轉染

以2.0×104cells/孔密度接種6 孔細胞培養板,48 h后更換新鮮培養液，用無血清DMEM培養液分別稀釋質粒pEGFP及pEGFP-PC1-5TMC，用Lipofectamine 2000 試劑進行轉染。在37℃，5% CO2環境中6 h后，更換培養液為DMEM繼續培養。

1.3 Western blotting法鑒定轉染細胞

轉染后24 h，各組細胞加入RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，12 000 g速度離心后取上清液，使用BSA試劑盒進行蛋白含量測定，后取80 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移到硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，1∶2 000加入GFP單抗4℃孵育過夜，TBST液清洗3次后，1∶500加入對應的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 4℃孵育過夜，按化學發光試劑盒說明書進行測定。

1.4 RNA干擾實驗

PP2A-B56α亞基、A亞基和C亞基的siRNA被分別用來干涉HEK293T細胞中的PP2A-B56α，A亞基和C亞基基因，siRNA基因敲除的效率通過免疫印跡進行評估。

1.5 細胞增殖實驗

較諸于國別文學，比較文學提供的是一種更為開闊的文學視域，讓學者在探求不同國家之文學的同時，能夠把文學作品放在世界文學的格局和世界文學發展的長河中進行觀照，不僅能使我們更深入地了解自己國家和民族的文學，而且能對世界其他國家和民族的文學有“了解之同情”，從而知曉我們自身文學的特異之處，清楚別的國家的文學同我們自身文學的差異之所在，并能辨考其間相互影響的痕跡，或彼此共通的文學特質。有鑒于此，季羨林先生特別指出：

將HEK293T細胞瞬時轉染PC1-5TMC至100 mm培養皿，轉染24 h后，采用Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒按既往研究所述進行細胞增殖試驗[3,6]。應用酶標儀檢測各孔光密度值(optical density，OD)，并計算細胞增殖率，細胞增殖率(%)=OD測試/OD對照×100%。

1.6 數據處理

數據以平均值±標準誤表示，使用Sigma Plot 11軟件對數據進行統計分析，P值小于0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PC1基因重組質粒轉染HEK293T細胞株的鑒定

空白質粒及pEGFP-PC1-5TMC質粒上均攜帶有綠色熒光蛋白(GFP)，采用GFP單抗用Western blotting法觀察在分子量約68 KD大小處顯示 pEGFP-PC1-5TMC蛋白條帶，即pEGFP-PC1-5TMC質粒轉染成功(圖1)。

條帶 1:空白對照組；條帶 2:轉染組.

2.2 PP2A各亞基基因干涉效果鑒定

以HSP-60為內參對照，Western blotting結果提示，與非干涉組相比，PP2A-A干涉組、PP2A-C干涉組以及B56α干涉組各自亞基表達水平下降(圖2)。

圖2 Western blotting法驗證各亞基表達

2.3 各組細胞增殖率

在既往研究中，我們證實PC-1抑制細胞增殖是PP2A/B56α依賴的[3]，為了進一步明確PP2A的A和C亞基對該過程的影響，我們采用siRNA敲除后的PP2A 3個亞基及對照進行增殖實驗來驗證。結果顯示PP2A-A或PP2A-C的敲除并不影響PC1-5TMC對細胞增殖的抑制，而B56α的敲除則消除了抑制作用(圖3)，從而支持PC1通過PP2A(B56α)而不是PP2A的A或C亞基抑制細胞增殖。

圖3 Alarma Blue測定法比較各組細胞增殖抑制率

3 討論

PC-1的異常改變是遺傳性多囊腎病發病的關鍵因素之一，其多表達于遠端腎單位和集合管中，通過多種途徑調節腎上皮細胞的增殖活性。例如通過平衡Ca2+/cAMP濃度抑制腎上皮細胞增殖，負性調節mTOR及下游信號分子S6激酶和4EBP1/eIF4E抑制細胞生長等[5]。我們前期的研究證實了PP2A作為4EBP1和p70S6K的去磷酸化受體，參與了PC1通過mTOR途徑介導的增殖抑制，且證明調節亞基B56α參與其中[3]。

PP2A作為異源三聚體復合物，還包含有結構亞基PP2A-A和催化亞基PP2A-C。其中，結構亞基PP2A-A是一段包含15個串聯重復序列的支架蛋白，全長65 kDa，可分為α、β兩型。催化亞基PP2A-C全長36 kDa，與PP2A-A亞基一同構成PP2A去磷酸化的核心酶[7]。B亞基家族之間的同源性非常低，具有組織、細胞及底物的特異性，其中B56是B亞基中基因最多樣化的家族，其4個亞基在許多組織和細胞中差異性表達，PP2A的功能和活性主要依靠調節亞單位B56α[8]。

本研究為探討PP2A-A和PP2A-C是否參與了PC1對細胞增殖的抑制，對PP2A各亞基進行了siRNA干預，并通過免疫印跡證實干擾后各組對應亞基的低表達；通過增殖實驗我們發現PP2A-A或PP2A-C的敲除并不影響PC1-5TMC對細胞增殖的抑制作用，而B56α的敲除逆轉了這種作用(圖3)，這支持并驗證了PC1不是通過PP2A的A或C亞基，而是通過PP2A(B56α)抑制細胞增殖。

總之，本研究進一步驗證了PP2A在PC1抑制的細胞增殖中發揮作用的具體亞基，為進一步研究PP2A介導的PC1抑制細胞增殖的研究提供了基礎。