白茶對秀麗隱桿線蟲抗氧化損傷和抗衰老作用研究

李　慕

白茶對秀麗隱桿線蟲抗氧化損傷和抗衰老作用研究

李慕

（邵陽學院湖南邵陽422000）

文章選取秀麗隱桿線蟲為實驗模型，采用白毫銀針（Baihaoyinzhen, YZ）、白牡丹（Baimudan, MD）和壽眉（Shoumei, SM）來比較不同原料來源白茶的體內抗氧化和抗衰老作用。實驗結果顯示，3種白茶在百草枯誘導的急性氧化應激秀麗隱桿線蟲模型中，均表現出良好的抗氧化、抗衰老作用。在壽命和體內抗氧化酶含量測定實驗中，3種類型的白茶測試的濃度中均以1 000 mg/L的濃度效果最佳，并且在該濃度下，白毫銀針的抗氧化作用明顯強于白牡丹和壽眉，而白牡丹與壽眉無明顯差異。在分子水平上，白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴于經典的Insulin/IGF-1信號途徑。

白茶；百草枯；抗氧化損傷；抗衰老

如何延長生物壽命、延緩衰老，一直是科研工作者關注的熱點問題。衰老是一個十分復雜的過程，由于科研工作者觀察角度、研究方法的不同，關于衰老機制的學說也不盡相同。其中衰老的自由基學說認可度較高，其認為氧氣進入生物體后會轉變為活性氧自由基，過量的自由基會導致機體內氧化損傷的累積，從而導致機體衰老[1]。而生物體內所含的抗氧化酶體系及外部攝入飲食中所含的抗氧化活性物質能夠通過終止自由基反應，減少自由基的產生并增長個體的壽命[2-3]。秀麗隱桿線蟲的生命周期短，培養條件簡單、易于操作，且具備完備的發育和解剖學特征及復雜的遺傳學特征。其抗氧化及抗衰老相關基因與人類高度同源，使其成為在衰老研究領域中國際公認首選的模式生物。

白茶是我國傳統的六大茶類之一，有研究證明，白茶具有良好的抗突變、抗癌、抗氧化效果，并且在神經保護、預防糖尿病及生殖健康等方面有諸多效果[4]。但有關白茶的抗氧化損傷研究多數是體外實驗[5]，體內功能實驗較為缺乏。利用秀麗隱桿線蟲作為模式生物，體內研究白茶的抗氧化損傷、抗衰老功能以及分子機制少有報道。因采摘和制作工藝的不同，造成不同種類白茶含有的化學活性物質存在較大的差異，其抗氧化和抗衰老效果也可能會有所不同。本研究選取3種代表性白茶（白毫銀針、白牡丹和壽眉）為研究對象，以秀麗隱桿線蟲為動物模型，旨在探討不同白茶提取物的抗氧化和抗衰老效果的差異和分子機制，為白茶促進人體健康，延緩人體衰老的保健功效提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與實驗動物

實驗選取白茶為2018年白毫銀針（Baihaoyinzhen, YZ）、2018年白牡丹（Baimudan, MD）、2018年壽眉（Shoumei, SM），制于福建福鼎。

白茶提取物制備過程：取200 g白茶葉進行粉碎，過200目篩，獲得白茶干粉；白茶干粉加入2 500 mL 50 ℃～60 ℃的純凈水中，攪拌均勻，加入植物水解酶，在超聲波輔助下酶解4 h～6 h，滅酶，經過高速離心取上清液，即得提取液；通過超濾膜對提取液進行過濾，對于不同提取物選擇相應溫度進行真空濃縮，并干燥、儲存。

實驗動物為秀麗隱桿線蟲N2品系、GA186突變型品系。

1.2 實驗方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲壽命實驗

秀麗隱桿線蟲壽命實驗分為非氧化應激組和氧化應激組兩大組（各3個平行），每個大組里又分3個白茶提取液處理組（處理濃度分別為100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L）以及1個空白對照組（0 mg/L）。將野生型（N2品系）同步化的秀麗隱桿線蟲在不同濃度的3種白茶提取液培養皿中培養至L2時期后，非氧化應激組不做氧化應激處理，氧化應激組使用2 mM百草枯進行氧化應激處理。各組的每個培養皿上20條～25條成蟲，定期轉板，非氧化應激組24 h記錄一次線蟲死亡數目，百草枯氧化應激組12 h記錄一次，在進行壽命統計時，以線蟲L2時期為記錄起始時間。

1.2.2 氧化應激組脂褐素分析實驗

選取存活率為20％的線蟲，NaN3麻醉后制片，在倒置熒光顯微鏡（參數為激發340 nm～380 nm，發射430 nm）下拍攝線蟲脂褐素熒光圖片，使用ImageJ軟件分析脂褐素熒光水平，并繪圖。

1.2.3 氧化應激組秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶含量分析

各組線蟲處理培養5 d后進行收集，平均分配后，每管大約500條成蟲，進行洗滌超聲破碎離心取上清液，根據SOD測定試劑盒的操作步驟來測定相關抗氧化酶含量。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，以均值±標準誤差表示；組間均值比較采用單因素方差分析，*表示＜0.05，差異顯著，**表示＜0.01，差異極顯著。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 白茶提取物對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

在非氧化應激組中，不同種類白茶提取液各濃度處理后線蟲的平均壽命如表1所示。3種白茶的3種濃度提取液處理組與空白對照組對比，平均壽命經過統計分析均無顯著性差異，說明在非急性氧化應激狀態下，在本實驗設定濃度范圍內，白茶提取液對秀麗隱桿線蟲的壽命沒有顯著性影響。

在百草枯處理的氧化應激組中，不同種類白茶提取液各濃度處理后線蟲的平均壽命如表2所示。白茶的3種濃度提取液處理組線蟲的平均壽命相比空白對照組有顯著的延長，其中白毫銀針組效果最為顯著，在100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L濃度下分別延長了19.3％、24.8％和31.8％。壽眉組與白牡丹組相比，線蟲的平均壽命沒有顯著性差異，延長壽命效果略差于白毫銀針組。實驗表明，在百草枯誘導的急性氧化應激組中，不同種類白茶提取液均對秀麗隱桿線蟲有保護作用，能夠提高秀麗隱桿線蟲氧化應激抵抗力，并且在測試的不同濃度中，1 000 mg/L濃度的效果最好。

表1不同濃度白茶處理后線蟲（非氧化應激組）的平均壽命統計（單位：d）

白茶類型提取液濃度/mg/L01005001 000 YZ20.09±1.1220.31±1.2320.46±1.0520.39±0.95 SM20.09±1.1220.01±1.1520.20±1.0520.30±1.22 MD20.09±1.1218.98±1.0320.23±1.2120.33±1.02

表2不同濃度白茶處理后線蟲（氧化應激組）的平均壽命統計（單位：d）

白茶類型提取液濃度/mg/L01005001 000 YZ3.11±0.853.71±0.95*3.88±0.98*4.10±0.90** SM3.11±0.853.41±1.10*3.52±1.15*3.67±1.08* MD3.11±0.853.39±1.03*3.49±1.13*3.63±1.02*

注：*代表與空白對照組相比，＜0.05；**代表與空白對照組相比，＜0.01。

2.2 白茶提取物對秀麗隱桿線蟲脂褐素的影響

圖1　3種白茶提取物對野生型（N2）秀麗隱桿線蟲脂褐素的影響比較（氧化應激組）

大部分生物在衰老的過程中，細胞內的溶酶體自噬后，未被消化的化合物和一些脂質會聚集在一起形成脂褐素，這種現象在秀麗隱桿線蟲中也存在。脂褐素可以自發熒光，可以通過熒光顯微鏡進行觀察。生物越是衰老，脂褐素濃度越高，可以觀察到的熒光強度越強，因此脂褐素熒光強度可以作為評價線蟲衰老程度的重要指標[6]。

百草枯誘導的急性氧化應激組中，在100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L的處理濃度下，白毫銀針組的脂褐素含量對比空白對照組分別下降了10.2％、14.1％和21.3％，壽眉組的脂褐素含量對比空白對照組分別下降了7.3％、10.2％和16.8％，白牡丹組的脂褐素含量對比空白對照組分別下降了6.9％、9.4％和15.7％。如圖1所示，3種白茶提取液的3個濃度處理下的脂褐素積累相比空白對照組均有下降，其中白毫銀針組效果最為顯著，壽眉組與白牡丹組沒有顯著差異。由此可知，脂褐素積累的下降趨勢和壽命延長的趨勢基本吻合。

2.3 白茶提取物對秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶含量的影響

細胞內過量的氧自由基、MDA、自由基和脂質氧化反應產物會導致細胞膜損傷，引起細胞衰老，而抗氧化酶（SOD）可以抑制這些物質對細胞的氧化損傷作用，因此，通過測定其活性可以評估生物的抗氧化損傷能力。鑒于在1 000 mg/L的濃度下，3種白茶提取液在對氧化應激組線蟲延長壽命和抑制脂褐素積累上效果最佳，本次實驗對象為氧化應激處理后的N2品系秀麗隱桿線蟲，3種白茶提取液濃度為1 000 mg/L，空白對照組濃度為0 mg/L。結果顯示，在急性氧化應激條件下，與空白對照組相比，白毫銀針組、壽眉組和白牡丹組線蟲體內SOD含量分別提高了61.1％、40.6％和35.3％（見圖2），說明白茶提取物可以提高線蟲體內SOD的含量，增強其抗氧化損傷的能力。同時，白毫銀針組提升效果高于壽眉組和白牡丹組，與前期壽命實驗和脂褐素實驗趨勢相吻合，也進一步證實了線蟲體內SOD活性、脂褐素積累情況與壽命之間存在高度相關性。

圖2　白茶提取物對野生型（N2）線蟲體內抗氧化酶含量的影響（氧化應激組）

2.4 白茶提取物對GA186品系秀麗隱桿線蟲壽命的影響

圖3　白茶提取物對GA186品系秀麗隱桿線蟲壽命的影響

影響線蟲壽命的最主要分子機制為Insulin/IGF-1信號途徑，其關鍵性基因有。為了分析白茶提取物對處于急性氧化應激條件下的線蟲的保護作用的分子機制是否與該經典途徑相關，本實驗選擇GA186（基因型為sod-3(tm760)X）突變型線蟲進行氧化應激實驗，用濃度為1 000 mg/L的3種白茶提取液進行處理，測定其壽命。收集實驗數據得出，空白對照組（0 mg/L）的平均壽命為2.88 d，白毫銀針、壽眉和白牡丹實驗組的平均壽命分別為2.77 d、2.83 d、2.70 d（見圖3）。實驗組與對照組線蟲平均壽命無顯著差異，說明白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴于經典的Insulin/IGF-1信號途徑。

3 結論

本研究結果表明，3種白茶提取物在急性氧化應激秀麗隱桿線蟲模型中，表現出良好的抗氧化、抗衰老作用。3種類型的白茶提取液的測試濃度中，均以1 000 mg/L濃度的效果最佳，其中在相同提取液濃度條件下，白毫銀針的抗氧化作用明顯強于白牡丹和壽眉，而白牡丹與壽眉無明顯差異。白茶提取物的主要成分為茶多酚、黃酮、咖啡因等物質，但是不能排除有極微量的小分子活性物質也在里面發揮著關鍵性的作用，所以本實驗中并未對3種白茶提取物的主要化學成分進行測定分析。有相關文獻報道，3種白茶的提取物中，白毫銀針的茶多酚、總黃酮含量要高于壽眉和白牡丹，壽眉和白牡丹的相關成分含量差別不大，而茶多酚和黃酮類物質體外和體內抗氧化能力顯著[7]，這從側面揭示了白毫銀針抗氧化、抗衰老作用明顯強于白牡丹和壽眉的原因，但是也不能排除在不同類型白茶提取物中可能存在其他微量的活性物質在發揮著關鍵性作用。

在生化水平上，3種白茶提取物均能提高線蟲體內SOD的含量，增強其抗氧化損傷的能力，延緩線蟲衰老。而在分子水平上，白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴于經典的Insulin/IGF-1信號途徑。

[1]GUTTERIDGE J M C,HALLIWELL B.Free radicals and antioxidants in the year 2000:a historical look to the future [J].Annals of the New York Academy of Sciences,2000,899(1):136-137.

[2]WILLIS L M,SHUKITT-HALE B,JOSEPH J A.Modulat-ion of cognition and behavior in aged animals:role for antioxidant-and essential fatty acid-rich plant foods[J].The American Journal of Clinical Nutrition,2009,89(5):1602S-1606S.

[3]MATES J M,SANCHEZ-JIMENEZ F.Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes[J].Frontiers in Bioscience:a Journal and Virtual Library,1999,4(4):339-345.

[4]呂海鵬,張悅,陳興華,等.不同花色種類白茶的抗氧化活性及其主要品質化學成分分析[J].食品科學,2016,37(20):42-50.

[5]楊皓彬,楊娜,柏雪,等.白茶中茶多酚提取工藝及抗氧化活性的研究[J].中國食品學報,2014,14(12):24-31.

[6]王懷玲.藍莓多酚化合物抗衰老活性及作用機制研究[D].廣州:華南理工大學,2018.

[7]曾琪,任發政,雷新根,等.白茶體外抗氧化與體內抗衰老作用的研究[J].茶葉科學,2018,38(6):615-624.

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.07.07

TS272.5

A

2095-1205(2022)07-20-03

湖南省教育廳一般項目“三種白茶的體內抗氧化損傷效果與機制研究”（18C0812）