胱天蛋白酶募集域蛋白9在胰腺腺泡細胞導管組織轉化中的作用

李清華 楊志文

1上海市松江區中心醫院消化內科，上海 201600；2上海市松江區中心醫院藥劑科，上海 201600

胰腺癌臨床表現隱匿、病情進展迅速、預后極差，5年生存率小于5%，中位生存期小于6個月[1]。胰腺腺泡細胞導管組織轉化是胰腺癌的起始事件之一，巨噬細胞通過多種途徑在其中起著重要作用[2-4]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain protein 9，card9)是巨噬細胞中一種重要的免疫炎性蛋白，可通過激活NF-κB等腫瘤炎性微環境中重要的信號分子，在胃癌、腎癌、結腸癌等腫瘤的發生和發展中起重要作用[5]。然而，card9在胰腺癌中的作用尚不清楚。本研究探討巨噬細胞card9在胰腺腺泡細胞導管組織轉化中的作用，從而闡明胰腺癌發生的分子機制。

材料與方法

一、siRNA-card9序列合成及巨噬細胞轉染效率

根據Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫以及小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)設計策略，設計3條靶向card9的siRNA(siRNA-card9)序列：siRNA-card9-1正向引物序列為5′-GGGUAAGCUAGACAGGAAUTT-3′，反向引物序列為5′-AUUCCUGUCUAGCUUACCCTT-3′；siRNA-card9-2正向引物序列為5′-CCCUCAGUUAUACCGGAAATT-3′，反向引物序列為5′-UUUCCGGUAUAACUGAGGGTT-3′；siRNA-card9-3正向引物序列為5′-GGACAAAGAUAAGCUUCGATT-3′，反向引物序列為5′-UCGAAGCUUAUCUUUGUCCTT-3′。3條siRNA-card9序列由上海吉瑪公司設計及合成。

巨噬細胞株購自上海中科院細胞庫，常規復蘇、培養及傳代。取對數生長期的巨噬細胞，以1×105細胞加入12孔培養板，加入200 nmol/L的綠色熒光素標記的siRNA-card9(購自上海吉瑪公司)，培養3、6、12、24、48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉染后的熒光強度，確定siRNA-card9轉染巨噬細胞的最佳時間。

取1×105巨噬細胞加入12孔培養板，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書步驟，分別用siRNA-card9-1、siRNA-card9-2和siRNA-card9-3轉染，每次設陰性對照組，每組各設3個復孔。采用實時定量PCR法檢測轉染后各組巨噬細胞card9 mRNA表達，篩選最佳抑制巨噬細胞card9的siRNA。card9正向引物序列為5′-CCAGAGCAGCCCTTTATG-3′，反向引物序列為5′-CTCGGTGTCGGTGTTGTC-3′；內參GAPDH正向引物序列為5′-GTGTTTCCTCGTCCCGTAG-3′，反向引物序列為5′-TTAGTGGGGTCTCGCTCC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 45 s，40個循環。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

將抑制率最高的siRNA-card9，以100、200、300 nmol/L 3個不同濃度轉染巨噬細胞，采用上述實時定量PCR法篩選巨噬細胞最佳抑制濃度。

二、巨噬細胞card9蛋白表達量檢測

將5×105巨噬細胞和100 μg/ml β葡聚糖分別加入6孔板，常規培養12、24 h后分成陽性細胞組(巨噬細胞)、β葡聚糖刺激陽性細胞組、陰性細胞組(card9-/-巨噬細胞)、β葡聚糖刺激陰性細胞組。每組設3個復孔。取各組細胞加入RIPA裂解液，常規蛋白質免疫印跡法檢測巨噬細胞 card9蛋白表達量。抗card9一抗(美國proteintech公司)1∶1 000稀釋，辣根過氧化物酶標記的二抗1∶200稀釋，反應后ECL發光，X片曝光、顯影、定影，Image J 軟件計算各條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示各組巨噬細胞card9蛋白相對表達量。

三、腺泡細胞導管組織轉化標志蛋白CK19表達檢測

分別取1×105巨噬細胞、1×105胰腺腺泡細胞(北京北納生物公司)加入Transwell小室上層和下層共培養，小室濾膜孔徑0.4 μm，100或500 μg/ml β葡聚糖加入上層巨噬細胞，分為以下6組：(1)陽性細胞組(巨噬細胞+腺泡細胞)；(2)陰性細胞組(card9-/-巨噬細胞+腺泡細胞)；(3)100 μg/ml β葡聚糖刺激陽性細胞組；(4)100 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細胞組；(5)500 μg/ml β葡聚糖刺激陽性細胞組)；(6)500 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細胞組。每組設3個Transwell小室，常規培養120 h。取各組下室胰腺腺泡細胞加入RIPA裂解液，免疫熒光化學染色法檢測腺泡細胞導管組織轉化標志物CK19蛋白表達。抗CK19單克隆抗體(英國abcam公司)1∶1 000稀釋，綠色熒光標記二抗1∶200稀釋，用PBS溶液清洗后加入100μl 0.5g/ml的DAPI核染液，4℃過夜，顯微鏡下觀察并拍照。

四、統計學處理

結 果

一、siRNA-card9轉染巨噬細胞的效率

倒置熒光顯微鏡下見綠色熒光素標記的siRNA-card9轉染3、6、12、24、48 h后，巨噬細胞內熒光強度隨著轉染時間延長而增加，24 h熒光強度明顯增加(圖1)，時間延長至48 h，熒光強度增加趨勢明顯變緩，故選擇24 h為siRNA-card9轉染巨噬細胞的最佳時間。

圖1 3(1A)、6(1B)、12(1C)、24(1D)、48 h組(1E)綠色熒光素標記的siRNA-card9轉染巨噬細胞的熒光強度

siRNA-card9-1、siRNA-card9-2和siRNA-card9-3均可成功轉染巨噬細胞(圖2)。陰性對照組及siRNA-card9-1、siRNA-card9-2、siRNA-card9-3轉染組巨噬細胞的card9 mRNA表達量分別為1.16±0.16、0.16±0.07、0.57±0.12、0.23±0.04。與陰性對照比較，siRNA-card9-1的沉默效率為83.9%(t=7.77，P=0.002)，siRNA-card9-2為43.4%(t=7.75，P=0.024)，siRNA-card9-3為76.8%(t=6.98，P=0.002)，提示siRNA-card9-1轉染巨噬細胞的抑制效率最高。

圖2 陰性對照組(2A)及siRNA-card9-1(2B)、siRNA-card9-2(2C)、siRNA-card9-3(2D)轉染組巨噬細胞的熒光強度

100、200、300 nmol/L濃度的siRNA-card9-1均可成功轉染巨噬細胞(圖3)。陰性對照組和100、200、300 nmol/L siRNA1-card9-1轉染組巨噬細胞的card9 mRNA表達量分別為1.01±0.18、0.40±0.06、0.15±0.02、0.27±0.0.4。與陰性對照組比較，100、200、300 nmol/L siRNA-card9-1的沉默效率分別為60.3%、84.4%、72.7%(t值分別為5.57、8.13、6.89，P值分別為0.005、0.001、0.002)。表明200 nmol/L為最佳抑制濃度，故后續實驗采用200 nmol/L siRNA-card9-1轉染巨噬細胞。

圖3 陰性對照組(3A)及100(3B)、200(3C)、300 nmol/L(3D)siRNA-card9-1轉染組巨噬細胞的熒光強度

二、β-葡聚糖刺激巨噬細胞上調card9蛋白的表達

陽性細胞組、β葡聚糖刺激陽性細胞組、陰性細胞組、β葡聚糖刺激陰性細胞組體外培養12 h，巨噬細胞card9蛋白表達量分別為0.86±0.05、1.03±0.05、0.59±0.03、0.52±0.16；體外培養24 h，巨噬細胞card9蛋白表達量分別為0.81±0.05、1.46±0.05、0.42±0.06、0.46±0.06。與陽性細胞組比較，β-葡聚糖刺激陽性細胞組巨噬細胞card9蛋白水平均明顯升高，差異有統計學意義(t=3.88，P=0.018；t=15.90，P<0.001)；與陰性細胞組比較，β-葡聚糖刺激陰性細胞組巨噬細胞card9蛋白水平未見明顯升高(t=0.70，P=0.525；t=0.78，P=0.475)，差異無統計學意義(圖4)，表明β-葡聚糖刺激可上調巨噬細胞card 9蛋白表達水平。

圖3 陰性對照組(3A)及100(3B)、200(3C)、300 nmol/L(3D)siRNA-card9-1轉染組巨噬細胞的熒光強度

注：card9為巨噬細胞胱天蛋白酶募集域蛋白9圖4 陽性細胞組(1)、β葡聚糖刺激陽性細胞組(2)、陰性細胞組(3)、β葡聚糖刺激陰性細胞組(4)培養12 h(4A)和24 h(4B)的巨噬細胞card9蛋白表達量

三、巨噬細胞誘導腺泡細胞導管組織轉化

陽性細胞組，陰性細胞組，100、500 μg/ml β葡聚糖刺激陽性細胞組，100、500 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細胞組體外培養120 h，陽性細胞組CK19蛋白綠色熒光強度較弱；100、500 μg/ml β葡聚糖刺激陽性細胞組和腺泡細胞內CK19綠色熒光強度較陽性細胞組明顯增強，且呈現β葡聚糖劑量依賴性；而陰性細胞組及100、500 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細胞組，腺泡細胞內CK19綠色熒光強度均較陽性細胞組顯著降低(圖5)，表明巨噬細胞誘導腺泡細胞導管組織轉化存在card9基因依賴性。

圖5 陽性細胞組(5A)、陰性細胞組(5B)、100 μg/ml β葡聚糖刺激陽性細胞組(5C)、100 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細胞組(5D)、500 μg/ml β葡聚糖刺激陽性細胞組(5E)、500 μg/ml β葡聚糖刺激陰性細胞組(5F)腺泡細胞CK19蛋白表達

討 論

大量文獻報道，真菌細胞壁的β葡聚糖與巨噬細胞膜表面C型植物凝集素受體-1特異性結合，誘導下游Sky活化，隨后card9招募bcl10、malt1，形成card9/bcl10/malt1復合體，進而激活NF-κB、p38等炎癥信號，釋放大量炎癥因子[6]。鑒于前期[7-8]大量可重復的β-葡聚糖活化巨噬細胞的實驗數據，本研究僅檢測巨噬細胞card9表達水平，用于驗證后續實驗的細胞模型。與先前報道[6-8]一致，本研究結果也顯示，β-葡聚糖刺激小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7后可上調card9的表達。

眾所周知，巨噬細胞對胰腺癌的腺泡細胞導管組織轉化起著關鍵作用[2-4]。巨噬細胞內的半胱氨酸蛋白酶，以及其分泌炎癥因子RANTES和TNF-α，作用于相關信號分子，促使腺泡導管組織轉化[2-3]；單克隆ICAM-1抗體[4]、氯化釓抑制劑[2]可阻遏巨噬細胞胰腺組織浸潤，抑制腺泡導管組織轉化。

本課題組前期研究發現，急性胰腺炎患者外周血巨噬細胞card9表達水平明顯升高[9]；沉默巨噬細胞card9可減輕急性胰腺炎大鼠胰腺的炎癥損傷[10]；存在巨噬細胞card9依賴性的NF-κB、038分子機制[11]。本研究發現，β葡聚糖活化巨噬細胞，上調card9蛋白水平，誘導腺泡細胞導管組織轉化，且呈現劑量依賴性；巨噬細胞card9基因敲除后，則抑制腺泡細胞導管組織轉化。

巨噬細胞card9可通過多種途徑參與腫瘤細胞生長繁殖。card9通過釋放IL-18炎癥因子[12]或者抑制骨髓源性抑制細胞[13]，調節輔助T細胞功能； card9調控固有淋巴細胞的免疫應答，激活腫瘤細胞STAT3信號途徑[14]； card9激活NF-κB信號分子，誘導巨噬細胞M2極化[15]。本研究結果表明，巨噬細胞與腺泡細胞共孵育后，巨噬細胞card9表達水平與腺泡細胞導管組織轉化標志蛋白CK19正相關，提示巨噬細胞card9可誘導腺泡細胞導管組織轉化。更深入的分子機制研究尚需在后續實驗中進一步闡明。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明李清華：實驗操作、論文撰寫、數據整理、統計學分析；楊志文：研究指導、論文修改、經費支持