三種牙膏配方的防腐挑戰實驗

邢叢衍 陳玉玲

(云南諾特金參口腔護理用品有限公司 云南 昆明 650212)

引言

在牙膏監管越來越嚴的今天，添加中藥提取物、草本成分的牙膏越來越多，但植物類提取物質量控制較難，特別是微生物經常超標。為了更好地了解牙膏成品的微生物警戒線，防腐挑戰試驗是比較直觀有效的方法。但牙膏還沒有專門的防腐體系檢測和評價標準，只能參考現行的化妝品防腐挑戰試驗進行改進，再完成牙膏的防腐試驗方法。對于試驗方法設計的難點在于代表性牙膏類型、培養基、中和劑、自選菌種的選擇，防止培養基的不適應、假陰性等造成結果的誤差，試驗前需先做好相關驗證工作，本研究不討論試驗前驗證工作。

選用苯甲酸鈉為防腐劑是因為在牙膏中的應用已經比較成熟，一般添加量在0.2%～0.5%，其防腐效能受pH值影響較大，殺菌和抑菌效力隨介質的酸度增高而增強，不適合用于碳酸鈣牙膏[1]。

經常年牙膏用中藥提取物的檢測，其帶菌量比較大，液體提取物中微生物繁殖快，在檢測中發現有芽孢存在。經過SN/T 0178-2011嗜熱菌芽孢標準和SN/T 2206.2-2009需氧芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌標準的檢測和驗證，證明大多數提取物帶菌為革蘭氏陽性蠟樣芽孢桿菌，兼性厭氧。其形態為白蠟狀，表面扁平、不規則、帶有光澤的近似圓形質地柔軟的菌毯，挑起來呈現絲狀，有很強的蔓延能力，對外界有害因子抵抗力強，會產生防御性內芽孢[2]。特選取蠟樣芽孢桿菌通過GB/T 4789.14-2014分離、純化，為自選菌種。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑

卵磷脂-吐溫80營養瓊脂培養基、SDA培養基、營養瓊脂培養基、TSA培養基、SCDLP液體培養基(培養基均為北京三藥)、生理鹽水。

1.2 實驗菌種

菌種：黑曲霉CMCC(F)98003、大腸埃希氏菌CMCC(B)44102、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、銅綠假單胞菌CMCC(B)10104、白色假絲酵母菌ATCC10231。廣東環凱微生物科技有限公司制造。

自選菌種：蠟樣芽孢桿菌。

1.3 實驗用牙膏

防腐劑均為苯甲酸鈉，用量均為0.2%，基礎配方中發泡劑均為十二烷基硫酸鈉，增稠劑均為CMC、黃原膠，保濕劑、香精、甜味劑等均一致。樣品無菌，不含氟。

樣品1：磷酸氫鈣與二氧化硅復配。

樣品2：二氧化硅透明兒童牙膏。

樣品3：功效牙膏，磷酸氫鈣，含中藥提取物。

1.4 中和劑選擇

依據《T/SHRH 017-2019》附錄B常見中和劑參考表，苯甲酸類防腐劑無對應中和劑。但存在K12等表活性物質，牙膏又屬于親水性膏體，培養基里已有卵磷脂和吐溫80，所以不再添加中和劑。

2 實驗步驟

2.1 菌種復蘇和傳代

菌種：用注射器全部吸出配套的復蘇液，再注入凍干菌種所在的瓶內，搖勻，吸取100微升菌液于培養皿中，細菌接種于營養瓊脂培養基，置于培養箱36℃±1℃培養48h，真菌、酵母接種于SDA培養基，置于培養箱28℃±2℃培養2～5天。

將復蘇后菌種傳代至第3代，細菌傳代培養基使用TSA，真菌、酵母使用SDA培養基，傳代培養條件與復蘇條件相同。

2.2 菌種懸濁液制備

將第3代菌種培養與于試管斜面，用10ml無菌生理鹽水沖洗菌苔至單獨的無菌試管中搖勻，細菌、真菌分別等比例混合，自選菌種單獨使用。

菌量選用：CTFA推薦量為霉菌10000CFU/ml，細菌1000000CFU/ml。

T/SHRH 017-2019中國團體標準為108CFU/ml。

2.3 試驗方法

依照不同標準有不同的方法，在此選用一次加菌28天試驗，同時監控pH數值。根據微生物數量變化來評價產品的防腐效果。

2.4 試驗步驟

3種樣品各取300g，每個樣品平均分裝于3個無菌錐形瓶中并編號，每個瓶中加入1種菌懸液1ml攪拌均勻，加了蠟樣芽孢桿菌、細菌懸濁液試樣培養在36℃±1℃，真菌、酵母懸濁液試樣培養在28℃±2℃。在試驗的第0、3、7、14、21、28天取樣試驗；使用含無菌玻璃球的90ml生理鹽水的錐形瓶，稱取10g樣品攪拌均勻，做8個稀釋度，每個稀釋度做平行樣，每次試驗的第一個稀釋度取10ml置于90ml已滅菌的SCDLP中觀察是否出現假陰性，細菌使用卵磷脂-吐溫80營養瓊脂培養基，真菌、酵母使用SDA培養基。計數按照《化妝品安全技術規范》(2015版)第五章進行。

2.5 評價方法選擇

根據不同的標準，目前有3種評價方法見表1。

表1 CTFA所用一次加菌的微生物防腐挑戰實驗評價標準

表2 T/SHRH 017-2019，T/GDCDC 010-2019防腐效果評價標準

防腐效果可以以菌落數的對數減少值(RX)作為評價指標。

計算方式見式(1)。

RX =lgNO-lgNX

(1)

式中：NO——菌液在樣品中的初始濃度；

NX——樣品在不同檢測時間的菌落數。

表3 國內參照CTFA加菌防腐挑戰性評價標準

其中表1、3相似，所以選擇CTFA一次加菌的微生物防腐挑戰實驗評價標準，和中國團體防腐效果評價標準進行評價和對比。

3 結果與評價

3.1實驗結果

選用中國團體標準的結果(見表4、表5、表6)。

表4 細菌檢測數據表

表5 自選菌檢測數據表

表6 真菌、酵母檢測數據表

pH值變化見表7。

表7 pH值檢測數據表

從表中可以看出細菌、真菌、酵母混懸液在剛加入時，防腐劑就開始起效，牙膏pH值也在逐步降低，細菌在第21天以后，真菌、酵母在第14天以后可以保持不大于10cfu/g，在以上3種牙膏類型中苯甲酸鈉防腐劑效果無太大偏差，對不同配方體系的影響不大。對于蠟樣芽孢桿菌，其能在牙膏中呈現增殖和自然減少的規律，可見苯甲酸鈉防腐劑和牙膏體系對其無任何防腐效果。

選用CTFA菌種濃度的所有樣品的結果為，霉菌第0～28天全未檢出，細菌第3～28天為0cfu/g，通過SCDLP培養后無假陰性存在，蠟樣芽孢桿菌第0～28天仍然存在104cfu/g。

3.2 評價對比

選用CTFA一次加菌評價標準來看全部優秀通過，但通過結果可以看出CTFA的加菌量和評價標準不適用苯甲酸鈉作為防腐劑的牙膏。

使用對數減少值(RX)作為評價指標，運用最嚴格標準Ⅰ計算(表8)。

表8

如表8所示，全部通過標準Ⅰ，但團體標準的評價方法也不太適用于牙膏，缺少T0、T3時間段的對數差評判。

4 結論

上述試驗表明，國內外防腐挑戰試驗方法可以基本滿足牙膏防腐試驗，但防腐效能評價方法對于牙膏來說，在評價時間上需要再細分T7以前的時間，來細化標準。

在上述配方中，苯甲酸鈉為防腐劑，其防腐效果差別不大，能通過防腐試驗數據對微生物的警戒線做判斷。但對于蠟樣芽孢桿菌的抑制效果來看，防腐體系是有重大缺陷的，往后在質量控制中，應盡量使用無菌的中藥、植物類提取物，研發也應盡快找到能包含蠟樣芽孢桿菌抗菌譜的防腐劑組合或單一防腐劑。