濁點萃取-高效液相色譜法同時測定煙用接裝紙中可萃取Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)

王 洋，韓維岐，郭莉莉，金 哲

(吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，吉林 長春 130000)

0 引 言

鉻元素廣泛存在于自然界中[1]，煙用接裝紙加工過程中會用到很多原料、染料、助劑等，加上環(huán)境因素，導(dǎo)致接裝紙中含有痕量的鉻[2-3]。在卷煙抽吸過程中，接裝紙直接與口腔接觸，其中含有的痕量鉻可能會遷移至體內(nèi)，對人體造成傷害。鉻元素在自然界中主要以三價鉻（Cr(Ⅲ)）和六價鉻（Cr(Ⅵ)）的形式存在，研究表明，Cr(Ⅲ)是人體必須的微量元素，在維持生物體葡萄糖平衡、蛋白質(zhì)與脂肪的代謝方面有重要作用[4]，而六價鉻具有高毒性，吸入會引起腎炎、貧血、神經(jīng)炎等疾病，具有強致癌性[5-7]。因此，準(zhǔn)確測定接裝紙中不同形態(tài)鉻的含量對卷煙危害性評價有重要意義。直接進行測定，不同價態(tài)之間會互相干擾，必須先分離后測定[8]。已有報道的分離方法主要有離子交換色譜法[9-10]、液-液微萃取法[11-12]、固相萃取法[12]、共沉淀法[13]、液膜萃取法[14]等。濁點萃取法[15]是近些年發(fā)展起來的一種環(huán)境友好型萃取技術(shù)，它以表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點現(xiàn)象為基礎(chǔ)，通過改變溫度、 pH 值、離子強度等參數(shù)使表面活性劑產(chǎn)生濁點析相，將親水性物質(zhì)與疏水性物質(zhì)分離，它不使用揮發(fā)性有機溶劑，已被成功用于痕量元素的分離富集。高效液相色譜(HPLC)同時具有分離和檢測的功能，本研究以吡咯烷二硫代甲酸銨(APDC)為螯合劑，曲拉通(Triton)X-114非離子表面活性劑為萃取劑，同時富集樣品中的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)，用HPLC分離并測定。該方法檢測限低，結(jié)果準(zhǔn)確性高，旨在為煙用接裝紙中鉻形態(tài)的準(zhǔn)確測定提供一種新的解決方案。

1 實驗部分

1.1 材料、儀器和試劑

材料：本研究所用檢測材料為煙用接裝紙，分別編號 a、b、c、d、e。

儀器：HY-8A數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；DU-14超聲儀（英國Clifton）；HB-03加熱鍋（北京萊伯泰科儀器有限公司）；TGL-16M臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DMT-2500多管漩渦混合儀（杭州米歐儀器有限公司）；Milli-Q10純水儀（美國 Millipore 公司）；ORION STAR A214 pH計（美國Thermo科技公司）；Agilent 1290高效液相色譜（美國安捷倫公司）。

試劑：乙酸（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸鈉（分析純，阿拉丁）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；曲拉通X-114（分析純，阿拉丁）；吡咯烷二硫代甲酸銨(APDC)（分析純，阿拉丁）；六價鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；三價鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

0.5%(V/V)Triton X-114：移取 5 mL Triton X-114用超純水定容至100 mL，再移取10 mL該溶液用超純水定容至100 mL即得0.5%(V/V)Triton X-114溶液。

0.1%(m/V)APDC：稱取0.1 g APDC用超純水溶解定容至100 mL。

1.2.2 樣品制備

將接裝紙樣品剪成0.5 cm×0.5 cm的碎片，混勻，取2 g（精確至0.000 1 g）于50 mL三角瓶中，加入20 mL超純水，超聲萃取30 min。取5 ml萃取液于10 mL離心管中，向其中加入2 mL 0.5%(V/V)Triton X-114溶液，2.5 mL 0.1%(m/V)APDC溶液，用0.2 mol/L乙酸鈉和0.2 mol/L乙酸調(diào)節(jié)體系pH為5.0，用超純水定容至10 mL。于55 ℃恒溫水浴30 min，趁熱離心（5 000 r/min）5 min，傾斜分離移除上層水層，剩余物用甲醇定容至1 mL，用0.45 μm有機相濾膜過濾至色譜瓶中，待測。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；檢測器：DAD 檢測器；檢測波長：254 nm；流量：1 mL/min；流動相：A相為水，B相為甲醇，梯度洗脫，時間程序如下：0～8 min，A∶B=25∶75；8.5～11.5 min，100%B；12 min，A∶B=25∶75；運行時間：12 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

分別取1 mL濃度為1 mg/L的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標(biāo)液于10 mL離心管中，加入2.5 mL 0.1% (m/V)APDC溶液，2 mL 0.5%(V/V)Triton X-114溶液，依上述方法操作得待測樣品，用DAD檢測器在波長210～640 nm范圍進行掃描，可得兩者吸收曲線，見圖1。據(jù)圖可知，兩者都在254 nm出現(xiàn)最大吸收，故選擇254 nm為檢測波長。

圖1 兩種離子螯合物吸收曲線

2.2 pH值優(yōu)化

在濁點萃取過程中，樣品溶液的pH對金屬螯合物的形成和提取有著很重要的作用，本研究考察了pH 3.0～9.0范圍對檢測結(jié)果的影響（0.5 mL濃度為 100 μg/mL的 Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)標(biāo)液依上述實驗方法操作），結(jié)果見圖2。圖中，relative peak area指在同一考察因素條件下，色譜峰面積相對于最大峰面積的比值。從結(jié)果可以看出，隨著pH的增大，結(jié)果呈先增大后減小的趨勢，在pH值為5.0時，兩種離子螯合物的檢測結(jié)果達到最大值，選擇pH 5.0為最佳反應(yīng)條件。

圖2 pH對結(jié)果的影響

2.3 APDC用量的優(yōu)化

Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)離子可以和吡咯烷二硫代甲酸銨(APDC)發(fā)生螯合反應(yīng)生成不同的有機螯合物，從而進行分離。因此，APDC的用量會對結(jié)果產(chǎn)生重要影響。本研究考察了不同APDC用量的影響（0.5 mL 濃度為 100 μg/mL 的 Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)標(biāo)液依上述實驗方法操作，加入0.1%(m/V)APDC溶液體積范圍0.5～3 mL），結(jié)果見圖3。由結(jié)果可以看出，兩種離子螯合物的檢測結(jié)果隨著APDC用量的增加而增加，在0.1%(m/V)APDC溶液加入體積為2.5 mL時達到最大值。因此，選擇0.1%(m/V)APDC加入量為2.5 mL。

圖3 APDC用量的影響

2.4 表面活性劑的優(yōu)化

Triton X-114作為一種常用的表面活性劑，具有友好的濁點溫度（22～25 ℃），非常便于實驗操作，本研究選擇Triton X-114作為表面活性劑，并考察了其用量對結(jié)果的影響（0.5 mL濃度為100 μg/mL的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標(biāo)液依上述實驗方法操作，加入 0.5%(v/v)Triton X-114的體積范圍 1～4 mL），結(jié)果見圖4。從結(jié)果可以看出，0.5%(V/V)Triton X-114加入量為2 mL為最佳條件。

圖4 Triton X-114用量的影響

2.5 反應(yīng)溫度優(yōu)化

溫度對化學(xué)反應(yīng)有著重要影響，金屬離子的螯合反應(yīng)也不例外，為獲得最佳檢測效果，本研究對反應(yīng)溫度30～70 ℃范圍進行了優(yōu)化（0.5 mL濃度為 100 μg/mL的 Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)標(biāo)液依上述實驗方法操作），結(jié)果見圖5。由圖可知，檢測結(jié)果隨著溫度的升高而升高，在55 ℃時達到最大值，最佳反應(yīng)溫度選擇55 ℃。

圖5 反應(yīng)溫度的影響

2.6 反應(yīng)時間優(yōu)化

反應(yīng)時間同樣對螯合反應(yīng)以及螯合物提取有著重要影響，本研究對反應(yīng)時間進行了優(yōu)化（0.5 mL濃度為 100 μg/mL的 Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)標(biāo)液依上述實驗方法操作，時間范圍10～40 min），結(jié)果見圖6。由圖可以看出，隨著反應(yīng)時間的增加，目標(biāo)物峰面積在增加，30 min時達到最大值，最佳反應(yīng)時間選擇30 min。

圖6 反應(yīng)時間的影響

2.7 流動相優(yōu)化

目標(biāo)物為金屬離子螯合物，且體系中含有Triton X-114，為達到使目標(biāo)物分離的效果，同時有效去除Triton X-114在色譜柱中的殘留，需使用有機相和水相組合的方式。本研究考察了甲醇和乙腈作為有機相和超純水的組合方式，通過大量實驗驗證，得出最佳流動相組合為甲醇和超純水，洗脫方式為梯度洗脫。流動相：A相為水，B相為甲醇，梯度洗脫，時間程序如下：0～8 min，A∶B=25∶75；8.5～11.5 min，100%B；12 min，A∶B=25∶75；運行時間：12 min。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

用超純水，采用逐級稀釋的方法得到濃度都為5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 μg/L 的 Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)混合標(biāo)液，按照上述優(yōu)化后的方法測定。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖7～圖8）分別為Y=3.239 2X+37.356 3；Y=6.575 3X+19.726 2相關(guān)系數(shù)分別為r2=0.999 6；r2=0.999 6。圖中，area表示色譜峰面積。將標(biāo)液逐級稀釋，以3倍信噪比所對應(yīng)濃度為檢出限，本研究方法檢出限分別為 14 μg/kg、10 μg/kg。

圖7 Cr(Ⅲ)離子螯合物標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 Cr(Ⅵ)離子螯合物標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.9 接裝紙樣品萃取方式優(yōu)化

將煙用接裝紙樣品a剪成0.5 cm×0.5 cm的碎片，混勻，取3份樣品于50 mL三角瓶中，每份2 g（精確至0.000 1 g），加入20 mL超純水，分別以浸泡、振蕩（180～200 r/min）、超聲三種方式萃取30 min。各取5 mL按實驗方法處理，測定其中目標(biāo)物含量，結(jié)果見表1。由結(jié)果可以看出，最佳萃取方式為超聲萃取。

表1 萃取方式的影響

2.10 接裝紙樣品萃取時間優(yōu)化

將煙用接裝紙樣品a剪成0.5 cm×0.5 cm的碎片，混勻，取6份樣品于50 mL三角瓶中，每份2 g（精確至0.000 1 g），加入20 mL超純水，超聲萃取15，30，45，60，90，120 min。各取 5 mL 按實驗方法處理，測定其中目標(biāo)物含量，結(jié)果見表2。由結(jié)果可以看出，隨著萃取時間的增加，Cr(Ⅵ)的測定結(jié)果有增加的趨勢，在30 min時即達最大值，選擇萃取時間為30 min。

表2 萃取時間的影響

2.11 回收率、精密度和富集因子

將接裝紙樣品a按上述過程處理，分別在3個濃度水平上進行加標(biāo)回收實驗，每個濃度平行測定6次，測定結(jié)果見表3。由結(jié)果得出，Cr(Ⅲ)回收率為 96.2%～103.6%，RSD為 4.6%～7.1%，Cr(Ⅵ)回收率為94.7%～104.4%，RSD為4.3%～8.5%，滿足痕量分析要求。

表3 精密度與回收率結(jié)果(n=6)

本研究還對目標(biāo)物富集因子進行了考察，選取濃度為20 μg/L的混合標(biāo)液2份，一份加入Triton X-114進行濁點萃取，一份不加入，其他條件按照優(yōu)化后的實驗條件處理，根據(jù)檢測結(jié)果得到Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的富集因子分別為15.3和20.1。

2.12 樣品測定

按照本研究的實驗方法，分別對4種不同接裝紙樣品進行了測定，結(jié)果見表4。從結(jié)果來看，部分接裝紙樣品中含有可萃取Cr(Ⅵ)，而不含有可萃取Cr(Ⅲ)。

表4 樣品測定結(jié)果

3 結(jié)束語

本文建立了同時測定煙用接裝紙中可萃取Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的方法——濁點萃取-HPLC法。通過優(yōu)化各項檢測條件，應(yīng)用建立的方法對接裝紙樣品進行抽檢，結(jié)果顯示，部分接裝紙樣品中檢測出可萃取Cr(Ⅵ)，Cr(Ⅲ)測定值均低于檢出限。本方法可以為行業(yè)制定相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持，對卷煙危害性綜合評價有重要參考意義。該方法檢測靈敏度高，穩(wěn)定性好，具有良好的精密度和較高的富集倍數(shù)，適用于煙用接裝紙中可萃取Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的同時測定。由于本文樣品中Cr(Ⅲ)的測定值均低于檢出限，如何進一步提高Cr(Ⅲ)的富集倍數(shù)，降低Cr(Ⅲ)的檢出限還需進一步研究。