不同采收期水冬瓜葉HPLC指紋圖譜研究及質量標志物預測分析

韓忠耀，張 濤，宋義勇，盧 洋，田 浩，王萬樂，曹 芳

(黔南民族醫學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000)

0 引 言

水冬瓜是山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia AngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu，地方標準記載以根皮入藥[1-2]，中華本草（苗藥卷）記載其葉也具有藥用價值[3]，水冬瓜葉可作為潛在替代根皮藥用植物資源被綜合開發利用[4]。

水冬瓜根皮含有熊果酸、7-羥基-6-甲氧基香豆素、紫丁香苷等化學成分[5-8]，根皮部位的化學成分類型主要為有機酸、生物堿、苯丙素類化合物等[9]。近年來，相關研究集中在根皮部位的提取工藝優化[10]、近紅外快速檢測[11]、生物活性[12-13]、指紋圖譜研究[14-15]及樹皮部位抗炎鎮痛活性[16]、指紋圖譜[17]等。據報道，水冬瓜葉含有金絲桃苷、異槲皮苷等化學成分[18]，有關水冬瓜葉的相關研究，主要為生藥學鑒定[19]及次生代謝產物經時變化特征分析[4]，課題組前期建立了不同產地水冬瓜葉指紋圖譜，而有關不同采收期水冬瓜葉指紋圖譜及質量標志物預測相關方面的研究尚無報道。

基于此，本研究采用HPLC法建立24批次不同采收期水冬瓜葉指紋圖譜，并采用主成分分析法和正交偏最小二乘判別分析法，預測分析不同采收期內24批次影響藥材質量的質量標志物，對不同采收期內水冬瓜葉藥材進行整體質量評價分析，為不同采收期黔產水冬瓜葉藥材的質量控制提供試驗依據。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀（配備DAD檢測器，美國安捷倫科技公司）；FA1004B型電子天平（萬分之一，溫州瑞昕儀器有限公司）；SHZ-D(Ⅲ)型循環真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；PX125DZH型電子天平（十萬分之一，成都川弘科生物技術有限公司）；HH系列數顯恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司）；KQ3200型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙腈（康科德色譜試劑500 mL，色譜純）；水為娃哈哈純凈水；甲醇（AR500 mL，科密歐試劑）；其他試劑均為分析純。

水冬瓜葉藥材自采于貴州省黔南布依族苗族自治州都勻市大坪鎮（經度：107°38′33″；緯度：26°13′46″；海拔 675.4 m），藥材經筆者鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia AngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的葉。藥材返青后，每月采集樣本1～3次。藥材采集信息見表1。

表1 藥材樣本采集信息表

2 實驗方法

2.1 色譜條件

為得到指紋圖譜最佳HPLC分離條件，在考察不同采收期水冬瓜葉HPLC指紋圖譜色譜條件時，重點對流動相的組成與比例進行了考察研究，發現在流動相的水相中添加適量磷酸，樣品色譜峰的分離度、峰形等均優于醋酸、甲酸。同時，對不同廠家色譜柱、檢測波長、柱溫等均進行了系統性考察，考察得到的色譜條件如下：

色譜柱：Agela Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流量：1.0 mL/min；流動相：0.2% 磷酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脫方式為梯度洗脫（0～20 min，90%→87% A；20～25 min，87%→81% A；25～40 min，81%→75% A；40～50 min，75%→55% A；50～65 min，55%→30% A；65～65.1 min，30%→90% A；65.1～70 min，90% A）；洗脫時間：70 min。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別稱量金絲桃苷、異槲皮苷對照品適量，精密稱定，置于同一個100 mL容量瓶中，先加適量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為0.090 1 mg/mL、0.087 2 mg/mL的混標溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取水冬瓜葉藥材適量，粉碎，過60目篩，混勻，備用。稱取粉末1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇100 mL，稱重，回流提取1 h，放冷，再稱重，用甲醇補足質量后過濾，再用0.45 μm微孔濾頭過濾，即得。

3 結果與討論

3.1 方法學考察

3.1.1 精密度試驗

取樣品Y12一份，參考文獻[18]，按2.3項方法，制得供試品溶液。按2.1項下色譜條件連續注入液相檢測6次，以“金絲桃苷”色譜峰（峰7）為參比峰的保留時間和峰面積作為參照，計算17個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，測定結果見表2。結果表明，建立的方法精密度較好。

表2 方法學考察結果（n=6）

3.1.2 重復性試驗

取同一樣品Y12共6份，參考文獻[18]，按2.3項下方法，制得供試品溶液。按2.1項下色譜條件分別進樣檢測，以“金絲桃苷”色譜峰（峰7）為參比峰的保留時間和峰面積作為參照，計算17個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，測定結果見表2。結果表明，試驗建立的方法重復性較好。

3.1.3 穩定性試驗

取樣品Y12一份，參考文獻[18]，按2.3項下方法，制得供試品溶液。分別在室溫條件下放置0，6，12，24，36，48 h，按 2.1 項下色譜條件注入液相分析檢測，以“金絲桃苷”色譜峰（峰7）為參比峰的保留時間和峰面積作為參照，計算17個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，測定結果見表2。結果表明，水冬瓜葉藥材供試品溶液在室溫放置48 h內穩定性較好。

3.2 不同采收期水冬瓜葉藥材HPLC指紋圖譜的建立與相似度評價

3.2.1 指紋圖譜的建立

取樣品Y1～Y24，按2.3項下方法，分別制得供試品溶液。按2.1項下方法分別注入液相儀進行檢測，HPLC圖譜數據導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004 A版）對24批次水冬瓜葉藥材樣本進行指紋圖譜分析。共確定了17個共有峰，其中，峰7為“金絲桃苷”色譜峰，峰8為“異槲皮苷”色譜峰，見圖1～圖3。以峰7“金絲桃苷”色譜峰為參比峰的保留時間和峰面積，分別計算17個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表3～表4。從表3可知，除峰7“金絲桃苷”色譜峰外，不同采收期內24批次水冬瓜葉藥材17個共有峰的相對保留時間RSD為0.02%～1.36%；從表4可知，除參比峰7號峰外，不同采收期內24批次水冬瓜葉藥材17個共有峰的相對峰面積RSD為23.25%～100.24%，表明不同采收期內，各共有峰峰面積波動較大。

圖1 24批次不同采收期水冬瓜葉樣品的HPLC疊加指紋圖譜

圖2 不同采收期水冬瓜葉藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜

圖3 混合對照品的HPLC圖譜

表3 24批次不同采收期水冬瓜葉藥材樣品共有峰的相對保留時間

表4 24批次不同采收期水冬瓜葉藥材樣品共有峰的相對峰面積

3.2.2 相似度評價

以“Y1”水冬瓜葉藥材樣本為參照圖譜，時間窗寬度為0.2 min，對Y1～Y24共24批次水冬瓜葉藥材樣本，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004 A版）進行相似度評價。結果，除Y19、Y23樣本外，24批次水冬瓜葉藥材樣本的相似度為0.861～0.973，見表5，表明不同采收期內水冬瓜葉藥材樣本基本穩定。同時，結合表4、圖2，研究也發現Y1～Y24批次樣本間，除17個共有峰外，還存在如峰a、峰b等峰，分布在Y1～Y24不同樣品批次且峰面積較大，但在Y1～Y24部分批次樣品中未檢測到（因此，峰a、峰b等吸收峰未作為試驗共有峰進行考察研究），說明不同采收期間樣本化學成分間仍然存在一定的差異性，客觀反饋了水冬瓜葉藥材不同生長期內次生代謝產物積累的差異性與經時變化的特征性。

表5 24批次不同采收期水冬瓜葉藥材樣品的相似度評價結果

3.3 主成分分析（PCA）

將不同采收期水冬瓜葉Y1～Y24共24批次17個共有峰的峰面積作為變量，導入SIMCA（12.0）化學計量學軟件進行主成分分析，24批次不同采收期水冬瓜葉樣品主成分得分圖見圖4，24批次不同采收期水冬瓜葉樣品主成分聚類圖見圖5。

圖4 24批次不同采收期水冬瓜葉樣品主成分得分圖

圖5 24批次不同采收期水冬瓜葉樣品主成分聚類圖（PCA-Class)

由圖4知，不同采收期水冬瓜葉Y1～Y24樣品呈現良好的時間分布特征性，而主成分聚類分析結果（見圖5）驗證了圖4。PCA將不同采收期24批次水冬瓜葉聚成3類，其中，Y1～Y5為第一類，Y6～Y11為第二類，Y12～Y24為第三類，聚類分析結果與藥材采集時間吻合，表明不同采收期內藥材質量呈現季節差異性特征。

3.4 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

將不同采收期水冬瓜葉Y1～Y24共24批次17個共有峰的峰面積作為變量，導入SIMCA（12.0）化學計量學軟件進行OPLS-DA分析，24批次不同采收期水冬瓜葉樣品投影的重要性（VIP）結果，見表6。構建的OPLS-DA數據矩陣模型評價質量參數，累積釋放能力參數R2X=0.851，反映模型穩定性的R2Y=0.910，預測能力參數Q2=0.802，參考文獻[20]可知，R2X、R2Y和Q2均大于0.5且接近1，說明本試驗構建的OPLS-DA數據矩陣模型擬合效果良好，穩定性與預測能力均較好。

表6 投影的重要性（VIP）結果1）

以 VIP＞1 為標準[20]，結果顯示峰 14、峰 15、峰11、峰 12、峰 7、峰 16、峰 8、峰 9和峰 17（按 VIP值由大到小排序）共9個共有峰的相對峰面積的投影的重要性VIP值大于1，除峰10、峰13和峰4外，其余14個共有峰VIP值均大于0.90，VIP值普遍較高，證實了HPLC指紋圖譜共有峰1～峰17所對應化學成分可以代表不同采收期水冬瓜葉藥材的整體質量，表明試驗篩選的指紋圖譜共有峰具有良好的科學性與代表性。經對照品比對，確認峰7為金絲桃苷吸收峰，峰8為異槲皮苷吸收峰。峰14、峰15、峰 11、峰 12、峰 7、峰 16、峰 8、峰 9和峰 17可初步擬定為不同采收期水冬瓜葉質量差異性代表的質量差異性標志物。

4 結束語

本試驗采用HPLC指紋圖譜[21-22]并結合化學模式識別分析技術對不同采收期24批次民族藥水冬瓜葉進行綜合質量評價，以考察不同采收期民族藥水冬瓜葉的質量特征并篩選了影響不同采收期藥材質量的關鍵性質量標志物?？疾觳煌墒掌诿褡逅嶩PLC指紋圖譜色譜條件時，對不同廠家色譜柱、流動相的組成及比例、吸收波長、柱溫等進行了系統篩選及優化，當流動相為0.2%磷酸水溶液-乙腈；檢測波長為210 nm；進樣量為10 μL；柱溫為35 ℃；流量為1.0 mL/min時，不同采收期內水冬瓜葉藥材的色譜峰信息相對豐富，峰形較好且分離度相對較高。依據相似度評價結果，24批次不同采收期內水冬瓜葉藥材相似度＞0.90的共有17批次，表明不同采收期內水冬瓜葉藥材質量基本穩定，但不同生長期內二次代謝產物積累呈現細微差異性，7批次相似度＜0.90的藥材，可能與生長期內部分次生代謝產物含量的高低動態積累經時影響相關。

綜上所述，本研究采用HPLC指紋圖譜并結合PCA、OPLS-DA化學模式識別方法，對不同采收期貴州特色民族藥水冬瓜葉開展了綜合質量控制研究，構建了其HPLC指紋圖譜評價方法，并對其質量標志物進行了預測分析。建立的HPLC指紋圖譜方法穩定、簡便，PCA聚類結果與樣本采集時間高度吻合，OPLS-DA預測的影響不同采收期水冬瓜葉藥材的9個質量標志物，峰14、峰15、峰11、峰12、峰 7（金絲桃苷）、峰 16、峰 8（異槲皮苷）、峰 9和峰17，可為不同采收期內水冬瓜葉藥材質量控制與評價提供參考。