肺腺癌相關組織學特征與PD-L1表達EGFR基因突變類型的關系*

謝雯瑩 賀洋 傅曉 王輝 吳燦 張大川 李青

肺癌是目前全球范圍內死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的病理類型。2019年美國癌癥生存統計報告顯示，NSCLC患者5年生存率約23%[1]。其中肺腺癌 （lung adenocarcinoma，LUAD）是最常見的NSCLC病理類型，約占所有肺癌的40%[2]。目前肺癌免疫治療已經取得了顯著的療效，其中以細胞程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）/細胞程序性死亡因子配體-1（programmed deathligand 1， PD-L1）為代表的免疫檢查點抑制劑是最有前途的癌癥治療藥物之一[3]，而PD-L1表達在肺腺癌不同組織學結構亞型中具有較強的異質性[4]。臨床研究表明，晚期NSCLC患者能從分子靶向藥物中尤其是酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治療中受益[5]。盡管NSCLC患者的治療手段越來越多，但除了EGFR突變、ALK重排/融合的患者外，其余NSCLC患者的總生存率幾乎未得到提高[6]。因此，本研究通過分析肺腺癌不同組織學亞型、氣道播散、胸膜侵犯等預后相關因素與PD-L1表達、EGFR基因的突變類型的差異分析，以期為臨床診療評判提供更為可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年1月至2020年12月蘇州大學附屬第三醫院病理明確診斷的肺癌標本，按下述入組標準進行篩選：手術切除標本，病理明確診斷為LUAD；檢測EGFR基因的突變狀態；術前未進行過免疫治療及靶向治療；可查閱到相關的臨床資料；所有病例的組織蠟塊保存完整。排除標準：合并其他原發性腫瘤；病理診斷為小細胞肺癌、腺鱗癌或其他特殊類型肺癌；原位腺癌。符合要求的樣本數為233例，其中男性94例，女性139例；年齡34～85歲，中位年齡65歲；腫瘤最大直徑0.6～9.0 cm，中位直徑2.0 cm；EGFR基因突變率為70.8%（165/233）。165例EGFR基因突變患者的突變類型包括19號外顯子缺失65例、21號外顯子突變92例（含Exon20 p.S768I、Exon21 p.L858R雙突變1例），其他突變類型8例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 所有標本組織均經10%中性緩沖福爾馬林固定后石蠟包埋，連續4 μm切片，在58℃±2℃下烘干1 h，PD-L1 IHC 22C3 pharmDx試劑在Dako Autostainer Link48儀器上配套使用。PDL1判讀由兩名高年資病理科醫師采用雙盲法判讀。對PD-L1判讀采用腫瘤比例評分（tumor proportion score，TPS）方法，是指部分或完整膜染色的腫瘤細胞占樣品中存在的所有活腫瘤細胞（陰性和陽性）的百分比。只包括腫瘤細胞可視的和明確的膜染色，染色的免疫細胞及細胞質染色的細胞不參與評分。PD-L1表達陰性：TPS＜1%；PD-L1低表達：TPS 1%～49%；PD-L1高表達：TPS≥50%。

1.2.2 ARMS法 使用人類EGFR基因突變檢測試劑盒（多重熒光PCR法，上海源奇生物醫藥科技有限公司）。按照操作規程檢測EGFR基因的突變。檢測位點包括：Exon18 G719S/G719C/G719A、Exon 19 Del、Exon20 Ins/S768I/T790M、Exon21 L858R/L861Q。結果判讀參照說明書指示。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。使用χ2檢驗、Fisher確切概率法分析PD-L1表達及EGFR基因與各臨床病理特征、LUAD組織學結構的關系以及PD-L1表達與EGFR基因突變狀態之間的關系；Pearson相關分析PD-L1表達與5種LUAD組織學結構之間的相關性。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1表達與患者臨床病理參數的關系

233例LUAD腫瘤組織中PD-L1陽性38.2%（89/233）、陰性61.8%（144/233）。男性、年齡≥65歲、低分化、腫瘤最大直徑≥2 cm以及淋巴結轉移、出現氣道播散和脈管、胸膜侵犯的患者PD-L1具有更高表達。其中PD-L1表達與腫瘤的分化程度、氣道播散及脈管、胸膜侵犯的差異具有統計學意義（均P＜0.001），為肺腺癌預后差的相關因素，PD-L1的表達與腫瘤的侵襲性顯著相關（表1）。

2.2 EGFR基因突變狀態與患者臨床病理特征的關系

233例LUAD患者中EGFR突變165例，陽性率70.8%，其中包含Exon18 p.G719A突變2例（1.2%），Exon18 p.G719X突變1例（0.6%），Exon19 Del 突變65例（39.4%），Exon20 Ins突變3例（1.8%），Exon20 p.S768I突變1例（1.2%），Exon21 p.L858R突變87例（52.7%），Exon21 p.L861Q突變4例（2.4%），Exon18 p.G719C、Exon20 p.S768I雙突變1例（0.6%），Exon20 p.S768I、Exon21 p.L858R雙突變1例（0.6%）。女性NSCLC患者的EGFR基因的突變狀態顯著高于男性NSCLC患者，差異具有統計學意義［78.4%（109/139）vs. 59.6%（56/94）；P=0.002，表1］。而EGFR基因的突變狀態與年齡、分化程度、腫瘤最大直徑、淋巴結轉移、氣道播散及脈管、胸膜的侵犯等差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.3 PD-L1表達和EGFR突變交叉陽性/交叉陰性與患者臨床病理參數的關系

233例LUAD患者中PD-L1表達與EGFR基因突變交叉陽性24.9%（58/233），交叉陰性15.9%（37/233）。PD-L1表達和EGFR突變交叉陽性/交叉陰性與腫瘤的最大直徑、淋巴結轉移、氣道播散及脈管、胸膜的侵犯等差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。此外，PD-L1表達和EGFR突變交叉陽性與腫瘤的分化程度有顯著性差異（P＜0.001）。PD-L1表達和EGFR突變交叉陽性/交叉陰性與腫瘤的侵襲能力顯著相關。

表1 PD-L1表達、EGFR基因突變狀態、PD-L1、EGFR交叉陽性/交叉陰性與LUAD患者臨床病理參數的關系 例

2.4 LUAD中PD-L1表達、EGFR基因突變狀態與組織學結構的相關性

本組LUAD依據2011年國際肺癌病理學研究委員會（IASLC）/美國胸科協會（ATS）/歐洲呼吸協會（ERS）肺癌多學科協作組發布的LUAD分類新標準進行分型，其中貼壁亞型、腺泡亞型、乳頭亞型、微乳頭亞型和實體亞型分別對應貼壁結構（腫瘤細胞沿肺泡壁表面生長）、腺泡結構（腫瘤細胞形成不規則的腺泡或腺管）、乳頭結構（腫瘤細胞沿纖維血管軸心呈乳頭狀結構）、微乳頭結構（腫瘤細胞呈缺乏纖維血管軸心的乳頭簇方式排列）和實體型結構（腫瘤細胞呈實性片狀排列，缺乏明確的腺泡、腺管和乳頭結構）。PDL1表達與貼壁結構（χ2=29.757）、微乳頭結構（χ2=16.275）及實體型結構（χ2=34.484）顯著相關，差異具有統計學意義（P＜0.001），EGFR基因突變狀態與乳頭結構（χ2=6.061，P=0.014）、實體型結構（χ2=6.668，P=0.010）差異具有統計學意義，見表2。

表2 LUAD中PD-L1表達、EGFR基因突變狀態與5種組織學結構的關系 例

對PD-L1表達比例及各結構比例進行定量，Pearson相關分析顯示PD-L1比例與貼壁結構（r=-0.252，P＜0.001）呈負相關，與微乳頭結構（r=0.271，P＜0.001）和實體型結構（r=0.473，P＜0.001）呈正相關，與腺泡結構（r=-0.111，P=0.092）及乳頭結構（r=-0.112，P=0.088）無相關關系（圖1，2）。

2.5 LUAD中PD-L1表達與EGFR基因突變類型的相關性

233例LUAD中EGFR突變型70.8%（165/233），野生型29.2%（68/233）。根據EGFR TKIs治療是否有效，將EGFR突變分為EGFR突變常見類型（敏感突變：Exon19 Del 突變，Exon21 p.L858R突變）及EGFR突變非常見類型（非敏感突變）。對165例EGFR突變進一步分型，其中EGFR突變常見類型92.7%（153例，含Exon20 p.S768I、Exon21 p.L858R雙突變1例），EGFR突變非常見類型7.3%（12例）。其中PD-L1表達與EGFR中Exon19 Del突變顯著相關，差異具有統計學意義（χ2=37.350，P＜0.001），而與其他突變類型差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

近年來由于免疫檢查點抑制劑的出現以及腫瘤免疫生物學的發展，免疫檢查點分子PD-1和PD-L1在NSCLC中的臨床意義已得到廣泛研究，其中PDL1在NSCLC中的過度表達常提示預后不良[7]。既往關于PD-L1蛋白在NSCLC的表達及其與臨床病理特征的關系尚無統一定論，有研究顯示無論NSCLC組織學分型如何，PD-L1在NSCLC腫瘤細胞中的陽性率約45%～50%[8]。其中Takada 等[9]采用免疫組織化學方法檢測497例LUAD組織中PD-L1的表達，表明臨界值為1%時PD-L1的陽性率為43.5%，PDL1表達與患者性別、淋巴結轉移情況等顯著相關，這與本研究結果較為一致。

2011年IASLC/ATS/ERS肺癌多學科協作組發布LUAD分類新標準，將LUAD根據形態學特征分為腺泡亞型、貼壁亞型、乳頭亞型、微乳頭亞型和實體亞型[10]。2020年IASLC評估了肺腺癌組織學亞型的標準并對患者預后進行關聯研究后，對2011年的LUAD分級方法進一步補充說明[11]，將微乳頭結構、實體型結構和復雜性腺體結構共同納入為高級別成分：1級（高分化腺癌）：貼壁亞型為主，≤20%的高級別成分；2級（中分化腺癌）：以腺泡亞型或乳頭亞型為主，≤20%的高級別成分；3級（低分化腺癌）：＞20%的高級別成分。研究定量分析了PD-L1表達與LUAD組織學結構的關系，發現PD-L1表達比例與微乳頭結構及實體型結構比例呈正相關，與本研究組的前期研究結果一致[12]。PD-L1的表達與LUAD分化程度顯著相關，分化差的LUAD其PD-L1的表達通常更高，這與2020年IASLC肺腺癌新分級方法一致。提示具有微乳頭結構及實體型結構的LUAD中PD-L1表達更高，腫瘤分化程度更差，即此兩種結構可能與LUAD腫瘤免疫微環境內免疫抑制相關，該類患者應用PD-L1抑制劑將可能獲得更顯著療效。

EGFR突變是NSCLC中一個最主要的驅動基因變異亞型，其激活性突變可以促進細胞的異常增殖、分化以及血管增生，并能抑制腫瘤細胞的凋亡。PIONEER研究[13]顯示，亞洲LUAD患者EGFR總體突變率達51.4%。EGFR熱點突變集中于激酶結構域18～21號外顯子，最常見為Exon19 Del、Exon21 L858R，其突變率約占EGFR總突變的80%以上[14]，與本研究結果一致。Jackman等[15]的臨床試驗發現，EGFR Exon19 Del突變的NSCLC患者相對Exon21 L858R突變患者具有更長的無進展生存期和總生存期。本研究探討了EGFR基因突變狀態與臨床病理特征的關系，認為EGFR基因突變狀態與患者的性別相關。此外，數據統計表明PD-L1表達和EGFR突變交叉陽性/交叉陰性與腫瘤的最大直徑、淋巴結轉移、氣道播散及脈管、胸膜的侵犯有關，顯示PD-L1表達和EGFR突變交叉陽性/交叉陰性與腫瘤的侵襲能力顯著相關。目前PD-L1仍是指導免疫治療的最佳生物標志物，有研究顯示NSCLC患者的PD-L1表達與EGFR突變率之間存在相關性[8]，與本研究結果一致。本研究顯示，LUAD患者中PD-L1表達與EGFR Exon19 Del顯著相關，無Exon19 Del突變患者中PDL1表達率遠高于Exon19 Del突變患者，意味著該部分患者將有可能成為PD-L1抑制劑免疫治療的優勢人群。但也有部分研究認為PD-L1表達與EGFR基因無關[16-17]。目前關于PD-L1表達與EGFR突變類型的相關性并無統一的結論，是該領域的研究熱點。

近年來，表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）治療成為EGFR突變 NSCLC的一線治療方案，免疫治療藥物PD-1/PD-L1抑制劑也成為肺癌患者最重要的抗癌武器，兩種方式均可以大幅度提升患者的生存期，然而免疫療法是否可以用于治療EGFR突變的NSCLC患者尚無定論。ATLANTIC研究[18-19]結果顯示，duvalumab（抗人PD-1單克隆抗體）作為三線（或以后）治療晚期NSCLC（包括EGFR+/ALK+NSCLC）將可能發揮更好的療效。Akbay等[20]研究證明EGFR激活有助于上調PD-L1在肺癌中的表達，而EGFR-TKIs的應用將有可能降低PD-L1的表達水平。目前第一代和第二代EGFRTKIs已成為Exon19 Del和Exon21 L858R的NSCLC患者的一線標準治療，第三代EGFR-TKIs可以使EGFR T790M突變患者從中受益，但獲得耐藥性幾乎不可避免[21]。Haratani等[22]研究發現，與T790M陽性患者相比，T790M陰性的EGFR突變陽性的NSCLC患者在EGFR-TKIs治療后更有可能從Nivolumab（抗人PD-1單克隆抗體）治療中受益，可能是因為其PDL1的表達水平更高。因此，盡管在EGFR突變患者中PD-1/PD-L1治療的反應低于EGFR野生型患者，但在獲得EGFR-TKIs耐藥的EGFR突變的晚期肺癌患者中，PD-L1的高表達仍然表明對抗PD-1/PD-L1抑制劑的反應更好。EGFR-TKIs耐藥患者最終能否受益于免疫檢查點治療以及免疫治療、化療、放療和靶向治療的最佳組合模式仍需要進一步探索。

本研究重點分析了PD-L1比例與LUAD組織學結構之間的相關性，PD-L1表達與貼壁結構、微乳頭結構及實體型結構顯著相關；以及肺腺癌PD-L1表達以及EGFR基因突變狀態與臨床病理特征之間的關系，證明在男性、年齡≥65歲、低分化、腫瘤最大直徑≥2 cm以及淋巴結轉移、出現氣道播散和脈管、胸膜侵犯患者中PD-L1表達陽性率較高；EGFR突變陽性率與患者性別相關；且PD-L1表達與EGFR中Exon19 Del突變顯著相關；PD-L1表達和EGFR突變交叉陽性/交叉陰性與腫瘤的侵襲能力顯著相關。但由于無患者相關的治療以及預后分析，并未對PD-L1表達、EGFR突變以及LUAD組織學結構與預后進行相關性研究，今后還需要更多的臨床數據進行驗證，將在后續的研究中進一步探討。