保健食品中喹諾酮類藥物常壓質譜快速檢測法

賀志喬，吳樹棟，朱富強，高翠

濱州市檢驗檢測中心（濱州 256600）

近年來，伴隨我國經濟社會飛速發展，保健食品行業也呈現迅猛發展態勢[1]。保健食品是指具有特定保健功能或者以補充維生素、礦物質為目的的食品。即適用于特定人群食用，具有調節機體功能，不以治療疾病為目的，并且對人體不產生任何急性、亞急性或慢性危害的食品[2]。隨著生活質量的提高，消費者日益注重自身健康和食品的保健功能，保健食品以其功能性和安全性成為更好的選擇[3]。然而，為謀取暴利不法商家向保健食品中添加非法藥物以增強保健食品的使用效果。長期服用非法添加藥物的保健食品嚴重影響消費者的身體健康，并帶來經濟損失[4-5]。因此，我國監管部門對保健食品非法添加藥物持續加強監管，檢驗檢測技術的提高也是持續關注的重點[6]。

保健食品中非法添加藥物常見的檢驗檢測技術有色譜法、色譜質譜聯用法、色譜光譜聯用法、直接質譜法、核磁共振波譜法、光譜法等[7-10]。其中質譜法以其分析速度快、靈敏度高、特異性強等特點得到廣泛應用。大氣壓固體分析探針（Ambient solid analysis probe，ASAP）是一種常壓離子化（Ambient ionization，AI）質譜分析技術，即在大氣壓環境下，無需或只需極少的前處理過程，可對固體探針攜帶的樣品直接進行熱脫附，經過電暈針放電離子化后進入質譜進行定性、定量分析[11]。ASAP質譜法在食品安全領域已有應用[12-18]，在保健食品非法添加物檢測方面的應用鮮見報道。喹諾酮類藥物是一類廣譜抗生素，添加至某些中成藥及保健食品中有快速高效的顯著效果[19-20]。針對保健食品中非法添加的喹諾酮類藥物，建立一種快速高效簡便的大氣壓固體分析探針質譜檢測方法，以期為保健食品安全監管提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準物質（溶劑均為甲醇，質量濃度均為100 μg/mL）：氟羅沙星、依諾沙星、奧比沙星、惡喹酸、培氟沙星、氘代恩諾沙星-D5（壇墨質檢科技股份有限公司）；司帕沙星（農業部環境保護科研監測所）；氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、洛美沙星、丹諾沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹、氘代諾氟沙星-D5、氘代環丙沙星-D8（BePure公司）。

試驗用水為超純水；甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；甲酸（色譜純，美國ACS恩科化學）；乙酸銨（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

市售固體和液體保健食品。

1.2 儀器與設備

Xevo TQ-XS三重四極桿質譜儀：配有大氣壓固體分析探針（Ambient solid analysis probe，ASAP）離子源（美國Waters公司）；MILLI-QADWANTAGE A10超純水機（美國密理博公司）；ME204T電子天平（精度0.000 1 g，上海梅特勒—托利多儀器有限公司）；3k15高速冷凍離心機（美國SIGMA公司）；SB25-12 DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取20粒市售保健食品油狀膠囊樣品，將其內容物混勻；取10～20粒粉狀膠囊樣品，去掉膠囊，將粉劑混勻；取10～20片的片劑樣品，置研缽中研磨均勻；取液體樣品搖勻。準確稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加入10.0 mL甲醇，超聲提取10 min，轉移至50.0 mL容量瓶中用水定容。過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.3.2 質譜條件

大氣壓固體分析探針離子源；ASAP正離子模式；掃描方式：多級反應監測；去溶劑氣溫度500℃；去溶劑氣流量1 000 L/Hr，錐孔氣流量150 L/Hr，霧化氣流量7.0 Bar，碰撞氣流量0.15 mL/min，電暈針放電電流0.7 μA。各物質的分子離子與特征碎片離子等質譜參數見表1。

表1 15種喹諾酮類藥物和3種內標物的質譜參數

1.3.3 上樣方式

按住ASAP源（圖1）外部的密封桿，取下進樣桿，插入封端毛細玻璃管至進樣桿頂端，用微量移液器將1 μL樣品處理液滴加至毛細玻璃管封端，將進樣桿快速插入ASAP源內部，確保毛細玻璃管封端和樣液不接觸其他組件。樣液經熱的氮氣流快速脫附，在電暈針放電作用下離子化后，直接進入質譜分析。

圖1 ASAP離子源及進樣桿[20]

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

影響ASAP源離子化效率的主要因素有去溶劑氣溫度、電暈針放電電流、氣流量、毛細管封端與電暈針和進樣錐孔之間的相對位置等。Waters Xevo TQ-XS三重四級桿質譜儀已將電暈針、進樣錐孔和源位置設置為最優狀態為固定值，氣流量選用推薦值，故質譜條件的優化重點在前兩者。

2.1.1 去溶劑氣溫度的優化

去溶劑氣溫度影響樣品處理液的氣化速度、待測物質的離子化效率、檢測靈敏度及峰形。在去溶劑氣溫度分別為250，300，350，400，450和500 ℃的條件下對15種喹諾酮類藥物進行試驗，發現去溶劑氣溫度在500 ℃時，響應值最高，峰形最好，易于積分，因此將去溶劑氣溫度設為500 ℃（圖2）。

圖2 去溶劑氣溫度對峰形的影響

2.1.2 電暈針電流的優化

ASAP源的電離需經電暈針放電進行離子化生成質子化或去質子化離子，有正離子和負離子兩種模式。在電暈針電流分別為0.1，0.3，0.5，0.7，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 μA的條件下進行試驗，每個樣品重復進樣3次，對比15種喹諾酮類藥物的峰面積，發現電暈針放電電流在0.7 μA時，大部分物質響應值最大，故電暈針電流設為0.7 μA（圖3為電暈針電流分別為0.5，0.7，1.0和1.5 μA時對峰形的影響差異）。

圖3 電暈針電流對峰面積的影響（1.0 μg/mL，n=3）

2.2 進樣方式的優化

2.2.1 樣品溶劑的優化

分別選取甲醇、乙腈、水及甲醇+水（1+1，V/V）為溶劑，配制1.0 μg/mL的標準物質溶液，每種標準物質溶液連續進樣分析7次，分析不同溶劑的待測物質在相同試驗條件下的響應值。發現大部分物質在水為溶劑時，有較高的響應值且精密度較好。優于乙腈、甲醇+水（1+1，V/V）和甲醇為溶劑的標準物質。分析原因可能為水的表面張力較大，易在毛細玻璃封端形成穩定的液滴，而甲醇、乙腈表面張力小、沸點較水低易揮發，因此選用水為標準物質溶劑（圖4）。

圖4 溶劑對峰面積的影響（1.0 μg/mL，n=7）

2.2.2 進樣方式的考察

ASAP離子源可采取將毛細玻璃管封端浸入或蘸取樣品溶液或樣品的形式進行上樣分析，考慮到這種進樣方式的精度較差，為提高進樣精度和準確度，采用微量移液器吸取1 μL樣品溶液，點加于毛細玻璃管封端的形式進行上樣分析。每個樣品連續進樣分析7次，對比外標法和內標校正法兩種方式下不同物質的峰面積和相對標準偏差SRSD，發現差別不明顯（圖5）。

圖5 進樣方式對峰面積相對標準偏差的影響（1.0 μg/mL，n=7）

2.3 ASAP-MS/MS定性定量分析

2.3.1 定性分析

15種喹諾酮類藥物經過質譜條件優化，分別確定一級質譜母離子的質荷比（m/z）與錐孔電壓，并選取兩個響應值最高的離子碎片作為二級質譜子離子進行定性，其中強度最高的離子碎片作為定量離子，次強碎片為定性離子。樣品中檢測到相同的母離子與子離子質荷比后，其子離子次強碎片的離子相對豐度，與濃度相近的標準物質的相對豐度相比，應在一定誤差范圍內，則可定性為樣品中存在對應的被測物質（表2）。

表2 定性確證時相對離子豐度的最大允許誤差

2.3.2 定量分析

直接質譜法因受到大氣壓環境、上樣方式等因素的制約，其定量的準確度與精密度較色譜質譜聯用法差，故為半定量分析。采用內標法對15種喹諾酮類藥物進行定量分析，用水配制質量濃度分別為10，50，100，200和500 ng/mL的系列標準物質溶液。其中氟羅沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依諾沙星和諾氟沙星以氘代諾氟沙星為內標；洛美沙星、奧比沙星、丹諾沙星、雙氟沙星和環丙沙星以氘代環丙沙星為內標；恩諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、惡喹酸和氟甲喹以氘代恩諾沙星為內標。以不同濃度標準溶液中的待測物質和內標物的峰面積之比為縱坐標，以標準物質溶液質量濃度為橫坐標，單位為ng/mL，建立標準曲線。按照3倍信噪比確定喹諾酮類檢出限SLOD為0.25 mg/kg，按照10倍信噪比確定定量限SLOQ為0.50 mg/kg。重復進樣分析質量濃度為10 ng/mL的標準物質溶液7次，計算精密度SRSD為10.1%～29.4%。15種喹諾酮類藥物在0.50～25.0 mg/kg質量分數范圍內線性關系良好，相關系數r均高于0.98，符合篩選方法[21]的要求（表3）。

表3 15種喹諾酮類藥物的線性范圍、回歸方程、相關系數及精密度

2.4 基質效應

分別選取有代表性的膠囊劑和片劑陰性樣品基質考察基質效應，比較不同基質標準物質曲線斜率與溶劑中標準物質曲線斜率的差異。分別用膠囊劑和片劑的陰性樣品提取液配制質量濃度為10，50，100，200和500 ng/mL的系列標準物質溶液，采取與上節相同的方式建立標準物質曲線。試驗結果表明，不同保健食品基質中標準物質曲線斜率存在差異，即存在基質效應，不同待測物質間差異不同。如圖6所示，氟甲喹在膠囊中的曲線斜率高于在片劑中和水中的曲線斜率，基質效應表現為基質增強。如圖7所示，雙氟沙星在片劑中的曲線斜率高于在膠囊中和水中的曲線斜率，基質效應表現為基質增強。氟甲喹的基質增強效應更為明顯。因此，ASAP源在該試驗過程中的應用應考慮基質效率，可采取基質添加或基質匹配的方式配制標準物質曲線，或進一步凈化和稀釋樣品處理液來削弱基質效應。

圖6 氟甲喹在不同基質中的標準曲線

圖7 雙氟沙星在不同基質中的標準曲線

2.5 樣品測定

試驗共收集市售保健食品9批，包括1批含油狀物膠囊劑，4批含粉狀物膠囊劑，3批片劑和1批液體保健食品。取每個樣品按1.3.1小節所述方式制備樣品提取液，按1.3.2小節質譜條件和1.3.3小節中內標法上樣方式進行測定，根據2.3小節定性定量方法對樣品進行分析。9種保健食品中均未檢出該15種喹諾酮類藥物，與液相色譜串聯質譜法的驗證結果一致。

選用一批片劑保健食品作為陰性樣品，按1.3.1小節所述方式制備樣品提取液，分別添加質量分數水平為0.5，2.5和5.0 mg/kg的15種喹諾酮類藥物標準物質溶液，按1.3.2小節質譜條件和1.3.3小節中內標法上樣方式進行測定，測得15種喹諾酮類藥物的平均回收率為59%～123%，精密度SRSD范圍分別為6.9%～46.4%，8.7%～36.4%和3.4%～31.9%。

3 結論

綜上所述，大氣壓固體分析探針質譜法為保健食品中喹諾酮類藥物的篩查提供了簡便快速高效的檢測方法。樣品前處理簡單快速經濟，無需色譜分離，實現多種物質同時快速分析，定性準確，可在大批量保健食品快速篩查或現場檢測等方面得到應用。與色譜質譜聯用方法相比較，存在上樣精密度較差的局限性，對操作人員的熟練程度有較高要求，有進一步加深相關研究的必要性。