酪乳中乳脂肪球膜成分的制備工藝

徐蘊桃，劉佳袆，孫顏君，劉振民，萬嗣寶

1. 乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院（上海 200436）；2. 上海大學生命科學學院（上海 200444）

乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）是包裹于牛乳中脂肪球表面的三層膜結構。其富含極性脂質，如鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿等[1]。它們具有調控膽固醇代謝、抗神經退化等作用[2]。在MFGM表面鑲嵌多種蛋白質，如嗜乳脂蛋白、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶等，它們具有防止細胞衰亡、提高機體免疫力的功能[3]。將MFGM作為功能性乳成分添加到不同產品中能提高其營養價值[4]。

酪乳（Buttermilk，BM）是黃油加工的副產物，是稀奶油經攪打后稀出的水相成分[5-6]，攪打時脂肪球之間碰撞，MFGM脫落到水相。工業生產黃油時，酪乳常丟棄或用于動物飼料[7]。隨著對MFGM深入了解，試驗開始研究分離MFGM的方法和添加到乳制品中[8-9]。將酪乳作為分離MFGM原料，能降低成本的同時也提高附加值[10]。

Holzmuller等[11]以酪乳為原料，經凝乳酶處理后用80 nm陶瓷膜超濾，可較好地去除酪蛋白和乳清蛋白。0.1～1.4 μm的陶瓷膜、0.22 μm聚偏氟乙烯膜等膜包[12～14]已應用于MFGM的分離處理，需考察不同分離參數對分離的影響[15]。過膜壓力、溫度等因素影響MFGM分離效果[16-17]，非優化條件得到的MFGM膜蛋白和極性脂質損失大。膜包材料和過濾系統也很關鍵，如改良聚醚砜膜材和聚偏二氟乙烯膜材表現出優良通透性及低膜蛋白吸附率[18-19]。切向流過濾系統可減少富集物堆積，提高過濾效率[20]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪乳（實驗室自制）；Lacprodan?MFGM-10（阿拉）；酪乳粉（恒天然）；0.22 μm Pellicon2Mini PVDF膜包（Milipore）；100 kDa Centramate T系列PES膜包（Pall）；BeyoGel? Plus PAGE預制膠、蛋白上樣緩沖液、蛋白標準品（10～150 kDa）、考馬斯亮藍快速染液、SDS-PAGE電泳液（Tris-Gly）（上海碧云天）。檸檬酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、無水氯化鈣（國藥集團）；凝乳酶（DANSICO）。

1.2 儀器與設備

PROTEAN3電泳儀、Geldoc-XR+凝膠成像儀（美國Bio-Rad）；CentramateTM table切向流過濾系統（Pall）；320型pH計（德國Mettler-Toledo）；Free-Zone-12L冷凍干燥機（美國Labconco）。

1.3 試驗方法

1.3.1 預處理方式對分離效果的影響

1.3.1.1 凝乳酶處理法

1 kg酪乳加0.03%凝乳酶，pH 調至6.8后45 ℃水浴30～60 min，結束后將酪蛋白凝乳液攪拌破碎，靜置1 h，收集上清液[11]。上清液使用100 kDa濾膜分離：過膜壓力0.5 bar，溫度25 ℃。超濾結束后向截留液中倒入與滲透液體積等量去離子水，并在相同分離條件下進行洗濾，重復5次，收集第1次截留液U0和經5次洗濾后的截留液U5，進行成分分析。

1.3.1.2 檸檬酸鈉處理法

1 kg酪乳加2%檸檬酸鈉解離，于4 ℃冷藏過夜[21]。解離液0.22 μm微濾分離，分離條件和洗濾過程同1.3.1.1小節。收集第1次截留液M0和經過5次洗濾后的截留液M5，進行成分分析。

1.3.2 洗濾次數對分離效果的影響

根據1.3.1小節成分分析結果，選擇合適的預處理方式。稱取預處理后酪乳500 g，過膜壓力0.5 bar、溫度25 ℃、料液pH 6.5過膜分離。洗濾重復8～10次，收集每次的截留液W0～W10，進行成分分析。

1.3.3 膜分離條件對分離效果的影響

取預處理后酪乳500 g，進行過膜條件優化。按過膜壓力0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 bar，分離溫度5，15，25，35和45 ℃，料液pH 5，6，7，8和9，進行單因素試驗。洗濾5次，最終截留液即為MFGM富集物。記錄截留液質量和入料酪乳質量，計算非膜蛋白清除率。各因素各水平試驗平行3次。

1.3.4 膜通量的測定

預處理后的酪乳進行膜分離，收集截留液。對截留液多次洗濾。記錄每次洗濾后滲透液質量M（kg），每次過濾時長T（h），膜包的面積為A（m2），膜通量[kg/（m2·h）]按式（1）計算。

1.3.5 非膜蛋白去除率和膜蛋白保留率的測定

采用標記型SDS-PAGE電泳法[22]對入料酪乳、截留液中非膜蛋白和膜蛋白進行相對定量。用Image Lab進行凝膠條帶分析。根據相對定量結果計算非膜蛋白去除率、膜蛋白保留率。結合試驗記錄的MBM、MMFGM及N，非膜蛋白清除率及膜蛋白保留率按式（2）和（3）計算。

式中：MBM、MMFGM為酪乳和MFGM富集物的質量（g）；NBM、NMFGM為酪乳和MFGM富集物上樣稀釋倍數；RCMFGM中非膜蛋白和RCBM中非膜蛋白為Image Lab分析的MFGM富集物和酪乳中非膜蛋白的相對含量（單位為1）。

1.4 數據分析和處理

采用SPSS軟件進行差異顯著性分析；Design-Expert.V 8.0.6進行響應面分析；Image Lab進行凝膠圖灰度分析。

2 結果與分析

2.1 預處理方式對分離效果的影響

由圖1蛋白電泳結果可知，酪乳經檸檬酸鈉和凝乳酶沉淀處理后5次洗濾，酪蛋白和乳清蛋白顯著降低，洗濾顯著提高非膜蛋白去除率。經凝乳酶沉淀處理酪蛋白膠束后，酪蛋白含量顯著減少，同時膜蛋白也顯著減少，因為酪蛋白發生凝聚時，部分乳清蛋白和膜蛋白被包裹在酪蛋白聚合體中[15]。圖2對比2種預處理方式對截留液中各類蛋白質含量的影響，經檸檬酸鈉處理，0.22 μm微濾得到的MFGM富集物中酪蛋白和乳清蛋白的去除率達48.6%和64%，且MFGM膜蛋白保留率可達70%。凝乳酶處理后經100 kDa超濾得到的MFGM富集物中酪蛋白去除率接近100%，乳清蛋白去除率達60%，而膜蛋白損失較為嚴重，損失率達82.56%。Holzmuller等[11]采用凝乳酶處理酪蛋白后使用80 nm材質膜包超濾分離，結果顯示酪蛋白、乳清蛋白去除率能達100%，各類膜蛋白損失率在20%～75%。凝乳酶處理會對膜蛋白造成無法避免的損失，優化凝乳條件后膜蛋白損失也達50%～70%[23]。

圖1 檸檬酸鈉解離（上）后經膜洗濾截留液和凝乳酶沉淀（下）后經膜洗濾截留液的蛋白質電泳圖

圖2 酪蛋白、乳清蛋白和MFGM膜蛋白保留率隨分離過程的變化

2.2 洗濾次數對分離效果的影響

單次膜分離會隨著濃縮倍數的增加，膜表面出現濃差極化效應[24]，膜通量達到最大值后出現急劇下降趨勢，并趨于平穩[17]。單次分離膜通量低，分離效果差，無法較好去除酪蛋白和乳清蛋白。補入洗濾液稀釋能使料液濃度下降，降低濃差極化效應，恢復膜通量[25]，有效改善分離效果[26]。以水為洗濾液能在低離子強度條件下增加膠體斥力，避免MFGM片段間碰撞、解體，最大限度減少MFG破損[27]。

2.2.1 洗濾次數對膜通量影響

圖3中洗濾至第5次時，膜通量趨于平穩，洗濾第5次（W5）和第8次（W8）不存在顯著性差異（P＞0.05）。W5和W0～W3存在顯著性差異（P＜0.05）。膜通量趨于穩定是因為在經過5次洗濾后，料液中被截留的物質不斷減少，并趨于穩定，加水稀釋后固形物濃度趨于穩定，膜通量也趨于定值[25]。

圖3 平均膜通量隨洗濾次數的變化

2.2.2 洗濾次數對蛋白的影響

圖4中非膜蛋白去除率隨洗濾次數增加呈上升趨勢，洗濾至第6次時達到最高值62.19%，之后趨于平穩，這與Jukkola等[17]的研究結果類似。乳清蛋白洗濾第1次時達較高去除率約84.05%，隨洗濾次數增加，去除率保持恒定是因為部分乳清蛋白與膜蛋白或MFGM片段通過二硫鍵結合[28]，被保留在截留液中無法去除，洗濾至第8次乳清蛋白去除率為87.88%。試驗發現增加洗濾次數帶來的剪切力會使部分MFGM片段發生解體，造成MFGM上小粒徑物質脫落[29]。因此洗濾次數5次較佳。

圖4 洗濾次數對非膜蛋白去除率的影響

2.3 分離條件對分離效果的影響

2.3.1 過膜壓力對分離效果的影響

如圖5所示，非膜蛋白去除率隨壓力增加先上升后下降，壓力0.5 bar時達最大值60.41%。一定壓力范圍內，過膜壓力越大，膜滲透通量越高，蛋白滲透通量隨之增加[17]。試驗采用切向流過濾裝置，壓力作用方向與膜面平行，可滲透的物質靠膜上孔徑攔截，料液流速過快，減少料液與膜包接觸時間，造成小分子物質進入截留管道，因此去除率反而下降[20]。

圖5 過膜壓力對非膜蛋白去除率的影響

2.3.2 分離溫度對分離效果的影響

如圖6所示，非膜蛋白去除率隨溫度增加先上升后下降，溫度35 ℃時達最大值78.21%。溫度降低，料液黏度會增加，膜通量降低，造成膜部分堵塞[25]。溫度適當升高，料液黏度降低，膜通透性增強。溫度超過40 ℃，乳清蛋白和料液中酪蛋白或MFGM片段結合，降低發生結合作用物質的透過率，從而降低非膜蛋白去除率。同時適當增加溫度能降低磷脂的膜透過率[12]，減少極性脂質損失。

圖6 過膜溫度對非膜蛋白去除率的影響

2.3.3 料液pH對分離效果的影響

如圖7所示，pH從5～9時，非膜蛋白去除率先上升后下降，pH 7時達最大值77.07%，pH較低時，蛋白之間發生集聚，粒徑增大，部分非膜蛋白無法透過膜包，減少膜通透性。pH增至堿性時，非膜蛋白去除率逐漸下降，在堿性條件下，蛋白質會發生肽鍵斷裂或高級結構改變[30]，發生聚集沉淀。在非中性條件下，膜包和蛋白所帶相反電荷會增多，增加相互排斥力。在中性條件下處于零電位，排斥力降到最小，增加了透過率[31]。Rombaut等研究發現膜分離時料液pH從4.6增至7.5，極性脂質的保留率從64%升至98%[14]，pH接近中性能降低極性脂質損失率。

圖7 料液pH對非膜蛋白去除率的影響

2.3.4 響應面分析膜分離條件對分離效果的影響

2.3.4.1 試驗結果

通過單因素試驗，經統計學分析過膜壓力、過膜溫度、料液pH對非膜蛋白去除率具有顯著影響，因此選取過膜壓力（A）、溫度（B）和料液pH（C）為自變量，以非膜蛋白去除率為響應值（T），進行響應面優化設計試驗。

表1 響應面試驗因素水平表

表3 響應面試驗模型回歸方差分析

通過Design-Expert.V 8.0.6軟件對表2的試驗數據進行二次多項回歸擬合，二次多項回歸方程為T=78.48+2.01A-0.49B-0.97C-2.19AB+0.20AC+4.63BC-4.40A2-6.71B2-0.39C2。

表2 響應面試驗結果

對二次模型進行系數顯著性檢驗及回歸方差分析。結果表明，模型P=0.001 7＜0.01，表明模型差異極顯著，試驗方案可靠。失擬項P=0.456 5＞0.05，表明該模型不存在失擬因素，該方程具有較好的擬合性。擬合系數R2=0.939 3，該模型能描述93.93%的響應值結果，非膜蛋白去除率93.93%的變化來自于所選變量，具有代表性，可用于分離條件優化。變異系數為2.74%，模型置信度較高，能較為準確分析3個變量對酪乳得率的影響。最終確定：過膜壓力0.58 bar，溫度30.66 ℃，pH 6時，非膜蛋白去除率可達80.454 8%。

2.3.4.2 響應面分析

圖8～圖10展示任意一個因素取零水平，其余2個因素對非膜蛋白去除率的交互影響。過膜壓力和溫度的交互作用強于溫度與pH和過膜壓力與pH之間的交互作用。

圖8 過膜壓力與料液溫度的交互影響

圖9 料液pH與過膜壓力的交互影響

圖10 料液pH與料液溫度的交互影響

2.3.4.3 條件優化驗證試驗

考慮試驗操作性，對條件作調整：過膜壓力0.6 bar，料液溫度31 ℃，料液pH 6。在此條件下制備非膜蛋白去除率79.07%，與理論值相近。經優化后非膜蛋白去除率從58.82%升至79.07%，顯著性提升20.25%（P＜0.05）。

2.4 自制MFGM富集物與市售產品對比

優化工藝后制備MFGM富集物并冷凍干燥，與市售BMP、市售MFGM成分對比，由表4可知，相同固形物質量的BMP中酪蛋白占蛋白含量約70%，膜蛋白占22.07%。市售MFGM中乳清蛋白含量占比較高為30.68%，酪蛋白含量顯著低于其他2組（P＜0.05）。自制MFGM中乳清蛋白占比為1.39%，比市售MFGM乳清蛋白（30.68%）降低29.29%（P＜0.05）。自制中膜蛋白占比41.81%，比市售提高8.79%。自制MFGM極性脂質占固形物含量1.54%，與市售BMP（1.56%）無顯著性差異（P＞0.05），與市售MFGM相比顯著提高0.68%（P＜0.05），說明工藝優化后制得的MFGM中極性脂質損失較低。

表4 3種MFGM產品中各成分含量

3 結論

以黃油加工副產物酪乳為原料，并對MFGM分離純化工藝進行優化，提高酪乳中非膜蛋白去除率，制得膜蛋白占比高，極性脂質損失少的MFGM富集物。通過對比，選擇添加2%檸檬酸鈉解離酪蛋白預處理酪乳，選擇0.22 μm孔徑的聚偏氟乙烯微濾膜包作為分離MFGM膜包材料。確定微濾洗濾次數為5次，以非膜蛋白去除率為指標優化分離條件，確定過膜壓力0.6 bar、料液溫度31 ℃、料液pH 6條件下制得的MFGM富集物非膜蛋白去除率為79.07%，與未優化分離條件的去除率相比提高20.25%。分離條件的優化能顯著提高膜蛋白在MFGM富集物中的占比，減少非膜蛋白比例，同時保證極性脂質保留率，純化效果較佳。