黑枸杞本草酵素的制備及功能研究

李東紅，李雪龍，李晶，矯艷平*，李麗娜，陳雪

1. 江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司（樟樹 331200）；2. 遠(yuǎn)大生命科學(xué)（遼寧）有限公司（沈陽 110000）

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr）為茄科（Solanaceae）、枸杞屬（Lycium L.）多棘刺灌木，果實(shí)肉質(zhì)肥厚，多分布于中國陜西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆等地。黑果枸杞味甘、性平，富含蛋白質(zhì)、枸杞多糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素、花青素等多種營養(yǎng)成分，其中花青素是最有效的天然水溶性自由基清除劑，具有抗氧化、抗疲勞等功效[1]。桑椹（mulberry）為桑科植物果實(shí)，紅紫色或黑色橢圓型聚花果，味甜且富含花色苷、黃酮、磷脂、脂肪酸等多種營養(yǎng)成分，具有良好的營養(yǎng)價(jià)值和藥用功效[2]。食用植物酵素是以可用于食品加工的植物作為原料，添加其他輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的酵素產(chǎn)品。其富含多糖類、礦物質(zhì)、有機(jī)酸、多酚類等生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)人體健康的作用，廣受消費(fèi)者喜愛[3-4]。

試驗(yàn)以黑枸杞和桑椹作為主要原料，添加低聚異麥芽糖、低聚果糖，通過益生菌發(fā)酵制備黑枸杞本草酵素。低聚異麥芽糖和低聚果糖的添加不僅可以改善產(chǎn)品的口味，且能明顯改善腸道內(nèi)微生物種群比例，是腸內(nèi)雙歧桿菌的活化增殖因子，可減少和抑制腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的產(chǎn)生，抑制有害細(xì)菌的生長[5-6]。試驗(yàn)通過優(yōu)化桑椹添加量、低聚果糖的添加量和發(fā)酵時(shí)間，獲得最佳感官狀態(tài)，并利用小鼠試驗(yàn)，測試小鼠食用產(chǎn)品后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的肝糖原變化、力竭游泳時(shí)間及血乳酸濃度和血尿素氮濃度的變化，對黑枸杞本草酵素抗疲勞效果進(jìn)行探究，為開發(fā)具有抗疲勞的功能性酵素產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞（中寧縣杞福源商貿(mào)有限公司）；桑椹（山東禾谷食品有限公司）；低聚異麥芽糖、低聚果糖（保齡寶生物股份有限公司）；雄性ICR小鼠（18～22 g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司）；血乳酸檢測試劑盒、血尿素氮檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DNP-420型培養(yǎng)箱（北京市永久光明醫(yī)療器械有限公司）；UPTB-10超純水機(jī)（上海申分分析儀器有限公司）；101A-3電熱恒溫干燥箱（北京市永久光明醫(yī)療器械有限公司）；JA2003N型精密電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；PHS-25B型酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)（沈陽鑫科之杰儀器化玻有限公司）；TG1650-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV-2000型可見紫外分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；PT-3502B 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）；SY-1S型實(shí)驗(yàn)室錯(cuò)流膜過濾器（紹興海納膜技術(shù)有限公司）；MF-1-10型實(shí)驗(yàn)室除菌過濾器（紹興海納膜技術(shù)有限公司）。

1.2 黑枸杞本草酵素的工藝流程

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 低聚果糖添加量對黑枸杞本草酵素感官的影響

以黑枸杞和桑椹為原料，選用植物乳桿菌、羅伊乳桿菌、鼠李糖乳桿菌為發(fā)酵菌株，確定桑椹添加量2%、發(fā)酵時(shí)間47 h，低聚果糖添加量分別為1%，2%，3%，4%和5%，以感官質(zhì)量為質(zhì)量檢測指標(biāo)，根據(jù)黑枸杞本草酵素的感官評分，研究低聚果糖添加量對感官品質(zhì)的影響。

1.3.2 桑椹添加量對黑枸杞本草酵素感官的影響

以黑枸杞和桑椹為原料，選用植物乳桿菌、羅伊乳桿菌、鼠李糖乳桿菌為發(fā)酵菌株，確定低聚果糖添加量3%，發(fā)酵時(shí)間47 h，桑椹添加量分別為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%，以感官質(zhì)量為質(zhì)量檢測指標(biāo)，根據(jù)黑枸杞本草酵素的感官評分，研究桑椹添加量對感官品質(zhì)的影響。

1.3.3 發(fā)酵時(shí)間對黑枸杞本草酵素感官的影響

以黑枸杞和桑椹為原料，選用植物乳桿菌、羅伊乳桿菌、鼠李糖乳桿菌為發(fā)酵菌株，確定低聚果糖添加量3%、桑椹添加量2%，發(fā)酵時(shí)間分別為45，46，47，48和49 h，以感官質(zhì)量為質(zhì)量檢測指標(biāo)，根據(jù)黑枸杞本草酵素的感官評分，研究發(fā)酵時(shí)間對感官品質(zhì)的影響[7]。

1.4 黑枸杞本草酵素最佳配方的確定

采用三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以感官評分為指標(biāo)，對低聚果糖添加量、桑椹添加量、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)黑枸杞本草酵素的加工工藝[8]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面編碼表

1.5 感官評價(jià)

選取50人對黑枸杞本草酵素產(chǎn)品進(jìn)行感官測評[9]，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 黑枸杞本草酵素特征性成分

黑枸杞本草酵素的特征性成分多酚、粗多糖及有機(jī)酸含量的測定委托譜尼測試集團(tuán)股份有限公司完成。

1.7 黑枸杞本草酵素微生物指標(biāo)測定

菌落總數(shù)參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》，霉菌參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》，大腸菌群參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》。

1.8 抗疲勞功能的試驗(yàn)探究

參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003年版）》中抗疲勞試驗(yàn)的方法，測定小鼠喂食黑枸杞本草酵素后小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、小鼠血乳酸濃度、尿素氮濃度、肝糖原的變化。

1.8.1 小鼠肝糖原的測定[10]

采用40只雄性小鼠，將小鼠分為4組：對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。每組10只。用已優(yōu)化制備好的黑枸杞本草酵素按5，10和15 mL/kg，對照組采用等劑量蒸餾水飼喂，試驗(yàn)期為30 d。

30 d試驗(yàn)周期結(jié)束后，處死小鼠后取出肝臟，與TCA溶液混合后離心放置，沉淀后再次離心，倒掉上清液，充分振蕩后至糖原完全溶解。空白試劑：選取等量蒸餾水加入離心管；標(biāo)準(zhǔn)試劑：選取等量標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水加入離心管。加入蒽酮試劑，測定其吸光度，根據(jù)肝臟質(zhì)量與肝糖原含量進(jìn)行換算，測得小鼠肝糖原含量（mg/g）。

1.8.2 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)及測定血乳酸濃度、尿素氮濃度

另選用40只雄性小鼠，將小鼠分為4組：對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。每組10只。用已優(yōu)化制備好的黑枸杞本草酵素按5，10和15 mL/kg，對照組采用等劑量蒸餾水飼喂，試驗(yàn)期為30 d。

末次灌胃30 min后，在小鼠尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于30 cm，水溫（25±1.0）℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡時(shí)間，即小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。取出小鼠，吹干毛發(fā)隨后斷頭取血，分離血清，按照試劑盒法測定血乳酸濃度和尿素氮濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均以X±S表示，組間差異方差分析：P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑枸杞本草酵素單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 低聚果糖添加量對黑枸杞本草酵素感官的影響選擇桑椹添加量2%、發(fā)酵時(shí)間47 h，考察不同低聚果糖添加量對于產(chǎn)品感官評分的影響。由圖1可知，低聚果糖添加量3%時(shí)，產(chǎn)品感官評分最高，為93.67分。原料添加黑枸杞、桑椹酸度較高，添加量超過3%時(shí)，破壞產(chǎn)品的糖酸比，醇厚度遭到破壞，影響黑枸杞本草酵素的口感和風(fēng)味[11]，因此選擇低聚果糖添加量3%為宜。

圖1 低聚果糖添加量對黑枸杞本草酵素感官評價(jià)的影響

2.1.2 桑椹添加量對黑枸杞本草酵素感官的影響

選擇低聚果糖添加量3%、發(fā)酵時(shí)間47 h，考察不同桑椹添加量對于產(chǎn)品感官評分的影響。由圖2可知，桑椹添加量2%時(shí)，產(chǎn)品感官評分最高，為92.00分。這是由于適量的桑椹可以調(diào)節(jié)飲料的色澤、口感和風(fēng)味，但過多會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品口感酸澀，影響產(chǎn)品的感官評分[12]，因此選擇桑椹添加量2%為最佳。

圖2 桑椹添加量對黑枸杞本草酵素感官評價(jià)的影響

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對黑枸杞本草酵素感官的影響

選擇低聚果糖添加量3%、桑椹添加量2%，探究發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)品感官評分的影響。由圖3可知，在47 h以內(nèi)，產(chǎn)品感官評分隨著發(fā)酵時(shí)間延長而升高，47 h感官評分最高，為91.33分。由于發(fā)酵時(shí)間延長，導(dǎo)致發(fā)酵過度產(chǎn)生較多乳酸，使得產(chǎn)品口感不佳，感官評分較低，因此選擇發(fā)酵時(shí)間47 h為宜。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對黑枸杞本草酵素感官評價(jià)的影響

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

在單因素基礎(chǔ)上，對低聚果糖添加量（A）、桑椹添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以感官評分為響應(yīng)值[13-14]，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和結(jié)果

2.3 回歸模型的建立及方差分析

應(yīng)用Design-Expert V 8.0.6軟件對表3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得回歸方程Y=92.2+0.88A+0.13B+0.5C+0.25AB+2.5AC+0.5BC-4.73A2-6.23B2-4.47C2。對模型方程進(jìn)行顯著性分析，見表4。

表4 回歸模型方差分析

由表4可知，影響無黑枸杞本草酵素感官評分的順序?yàn)榈途酃翘砑恿浚景l(fā)酵時(shí)間＞桑椹添加量。回歸方程模型P=0.001 6，該模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.273 5，不顯著，說明該回歸方程是可行的。模型的決定系數(shù)R2為0.940 9，Radj2為0.865 0，表明感官評分的實(shí)際值與預(yù)測值擬合較好。由此可知，各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系[15]。

2.4 響應(yīng)面兩兩因素交互作用

繪制響應(yīng)面的交互作用見圖4～圖6。

由圖4可知，發(fā)酵時(shí)間一定時(shí)，低聚果糖添加量與桑椹添加量交互作用不顯著。由圖5可知，桑椹添加量一定時(shí)，低聚果糖添加量與發(fā)酵時(shí)間交互作用顯著，且發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)品影響較大。由圖6可知，桑椹添加量和發(fā)酵時(shí)間交互作用不顯著，感官評分隨兩種添加物添加量的增加變化較大。利用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝參數(shù)：低聚果糖添加量3%、桑椹添加量2%、發(fā)酵時(shí)間47 h，模型預(yù)測感官評分為92.2分。為驗(yàn)證試驗(yàn)可靠性，選取最優(yōu)添加量制作黑枸杞本草酵素進(jìn)行感官評定，取3組平行，感官評分平均值為91.75分，與預(yù)測值相符，表明響應(yīng)面優(yōu)化黑枸杞本草酵素工藝的可靠性較高[16]。

圖4 低聚果糖添加量和桑椹添加量對產(chǎn)品感官評分的影響交互作用

圖5 低聚果糖添加量和發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)品感官評分的影響交互作用

圖6 桑椹添加量和發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)品感官評分的影響交互作用

2.5 黑枸杞本草酵素特征性指標(biāo)測定

疲勞是人體機(jī)能暫時(shí)下降的現(xiàn)象，同時(shí)是一種普遍存在現(xiàn)象。胡云峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)能源消耗，且代謝緩慢是造成疲勞的主要因素。活性成分如粗多糖、多酚等物質(zhì)具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效，尤其多糖類物質(zhì)可分解為能源物質(zhì)補(bǔ)充能量，起到抗疲勞作用[18]。

選用優(yōu)化后的配方制作黑枸杞本草酵素，測定特征性指標(biāo)結(jié)果如表5所示。多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可提高機(jī)體免疫力，黑枸杞本草酵素內(nèi)多酚含量為16 mg/g，有效成分含量較高。粗多糖含量為0.1 g/100 g，可以為機(jī)體提供能源，緩解機(jī)體疲勞。有機(jī)酸含量為2.4×104g/kg，可以刺激消化腺的分泌，增進(jìn)食欲，有利于食物的消化，同時(shí)調(diào)節(jié)產(chǎn)品風(fēng)味。

表5 黑枸杞本草酵素特征性指標(biāo)測定結(jié)果

2.6 微生物指標(biāo)測定結(jié)果

黑枸杞本草酵素微生物指標(biāo)測定如表6所示。產(chǎn)品內(nèi)霉菌未被檢測出，大腸菌群均小于10 CFU/mL，菌落總數(shù)檢測結(jié)果未被檢測出。由結(jié)果可知，產(chǎn)品檢測結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)。

表6 黑枸杞本草酵素微生物指標(biāo)測定結(jié)果

2.7 小鼠肝糖原測定

將經(jīng)過工藝優(yōu)化的黑枸杞本草酵素對試驗(yàn)小鼠進(jìn)行飼喂，測定小鼠肝糖原的變化。肝糖原的含量可以間接反映出小鼠機(jī)體疲勞狀態(tài)，因?yàn)樵谶\(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)肝糖原轉(zhuǎn)化為能源，使小鼠血糖保持平衡，且肝糖原儲(chǔ)藏量越大，小鼠運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)，抗疲勞能力越強(qiáng)[19-20]。小鼠體能肝糖原變化見圖7。

由圖7可知，低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠的肝糖原含量分別為35.44，60.87和81.13 mg/g，均高于對照組11.02 mg/g，且喂食小鼠黑枸杞本草酵素的劑量越高，小鼠肝糖原含量越高，小鼠體內(nèi)可供能量越大，疲勞耐受力越強(qiáng)，抗疲勞能力越強(qiáng)，說明服用黑枸杞本草酵素對于抗疲勞有一定的作用。

圖7 不同劑量黑枸杞本草酵素對小鼠肝糖原的影響

2.8 小鼠力竭游泳時(shí)間結(jié)果

抗疲勞直接的體現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)耐力提升，游泳時(shí)間的長短可以反映小鼠疲勞程度[21]。由表7可知，與對照組相比，低劑量組小鼠游泳時(shí)間為413.72 s，明顯升高。高劑量組小鼠與低劑量組小鼠相比差異性顯著，且明顯升高，表明黑枸杞本草酵素對小鼠負(fù)重能力有顯著提升作用。

表7 黑枸杞本草酵素對小鼠力竭游泳時(shí)間影響

2.9 小鼠血乳酸濃度、尿素氮濃度結(jié)果

在機(jī)體運(yùn)動(dòng)過程中，組織器官代謝功能加強(qiáng)，糖酵解反應(yīng)產(chǎn)生乳酸，使機(jī)體感到疲勞。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)乳酸含量與疲勞程度呈正相關(guān)，血乳酸水平反映機(jī)體疲勞程度[22]。黑枸杞本草酵素對小鼠血乳酸濃度影響如表8所示。與對照組相比，黑枸杞本草酵素顯著降低小鼠內(nèi)部血乳酸濃度，其血乳酸濃度由10.75 mmol/L下降到6.13 mmol/L，下降率達(dá)到42.98%。說明黑枸杞本草酵素可加快產(chǎn)物的消化代謝，降低乳酸含量。

機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，體內(nèi)糖原和脂肪不能滿足機(jī)體需要，此時(shí)需要消耗蛋白質(zhì)作為能源補(bǔ)給，蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物血尿素氮濃度會(huì)隨之增加，血尿素氮濃度越高，表明機(jī)體越疲勞[23]。黑枸杞本草酵素對小鼠血尿素氮濃度影響如表8所示。與對照組10.01 mmol/L相比，高劑量組血尿素氮濃度為7.20 mmol/L濃度顯著降低，下降率可達(dá)28.07%。說明黑枸杞本草酵素能減緩機(jī)體分解蛋白質(zhì)速度，提高機(jī)體抗疲勞能力。

表8 黑枸杞本草酵素對小鼠血乳酸濃度、尿素氮濃度影響 單位：mmol/L

3 結(jié)論

試驗(yàn)以黑枸杞和桑椹為原料，經(jīng)益生菌發(fā)酵，以感官評分為監(jiān)測指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化出黑枸杞本草酵素原輔料桑椹、低聚果糖添加量和發(fā)酵時(shí)間的最優(yōu)參數(shù)，即桑椹添加量2%、低聚果糖添加量3%、發(fā)酵時(shí)間47 h，優(yōu)化后的黑枸杞本草酵素產(chǎn)品清澈透亮，香氣醇厚，口感純正且回味甘甜，狀態(tài)均勻。經(jīng)特征性指標(biāo)測定黑枸杞本草酵素產(chǎn)品中含有較高的有機(jī)酸、粗多糖和多酚含量。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明，黑枸杞本草酵素具有明顯的抗疲勞作用，具有廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景。