紅棗多糖的硫酸酯化修飾及其結構特性的研究

符玉霞，郭欣，魏亞博，鄧小蓉，張建

石河子大學食品學院（石河子 832000）

紅棗，又稱大棗，鼠李科、棗屬植物的成熟果實。作為一種膳食補充劑，紅棗是公認的健康食品，含有多種生物活性物質，如蛋白質、氨基酸、維生素、生物堿、皂苷、礦物質和多糖[1]。植物多糖是廣泛存在于植物中的天然大分子，由于其獨特的特性，近年來在臨床上被廣泛用于增強機體免疫力、增強機體抗氧化能力、調節機體糖代謝等[2]。紅棗多糖是紅棗中一種重要的生物活性物質，研究表明紅棗多糖具有抗氧化、抗腫瘤、保肝和降血脂等多種生物活性[3]，可被廣泛用于食品行業和醫藥行業。

天然植物性多糖的分子修飾是目前研究的熱點，對多糖進行不同方法的修飾，可以提高其生物活性，可為保健食品和藥物應用提供重要原料[4]。硫酸化修飾是采用化學方法將硫酸基團引入多糖分子結構中，進而使多糖糖鏈結構中單糖分子的羥基被硫酸基團取代，與天然多糖相比，硫酸化修飾后的多糖生物活性更加廣泛和優越[5]。研究表明對洋蔥多糖進行修飾，可以顯著地提高多糖的抗氧化活性。小分子量的牛膝多糖有免疫增強活性，卻無抗病毒活性，經硫酸酯化修飾后，產生較強的抗乙肝病毒活性。

迄今為止，中國已發現7 000多個棗品種，其種植面積超過150萬 hm2[6]。隨著生活品質的提升和紅棗市場規模不斷擴大，紅棗產品的多樣化需求比較明顯，這與紅棗深加工產業的滯后形成矛盾，因外觀不良、未干制加工和腐敗變質的紅棗浪費嚴重[7]。另外，由于人們對自由基生物學的興趣日益濃厚，而對大多數慢性疾病仍然缺乏有效的治療方法，人們開始研究從植物中提取的天然抗氧化劑對氧化應激相關疾病的治療效果。通過對紅棗多糖的硫酸酯化修飾、結構表征、抗氧化活性的研究，以期提高原有生物活性或增加新活性，擴大多糖利用范圍，并應用于功能食品領域，則可實現紅棗產業的高值化應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗多糖（西安澤郎生物科技有限公司）；透析袋（截留分子量8 000～14 000 Da，上海源葉生物科技有限公司）；三氧化硫吡啶復合物（酯化劑）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one，PMP）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）：上海麥克林生化科技有限公司；1, 1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazine，DPPH）、2, 2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）]、抗壞血酸：國藥集團化學試劑有限公司；NaOH（天津市鑫鉑特化工有限公司）；K2SO4（天津市盛傲化學試劑有限公司）；聚乙二醇：polyethylene glycol，PEG，艾康生物技術（杭州）有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀（杭州賽析科技有限公司）；ENK-PRO型酶標儀（美國Bioteck公司）；NJF-120-01型掃描電子顯微鏡（蘇州晉松計量儀器有限公司）；Nicolet IS 10型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo公司）；HX-10-50B型真空冷凍干燥機（上海圣科儀器設備有限公司）；Agilent1260凝膠滲透色譜儀（北京普立泰科儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 紅棗多糖的硫酸酯化修飾

參考王瑞芳等[8]的方法。稱取0.5 g紅棗多糖于錐形瓶，磁力攪拌下加入20 mL DMF和10 mL吡啶，攪拌使其充分溶解，加入0.9 g三氧化硫吡啶復合物，放入水浴鍋使其反應完全，冷卻到室溫，用適宜濃度NaOH調節pH到中性，透析72 h，冷凍干燥得到硫酸酯化紅棗多糖。

硫酸酯化紅棗多糖取代度的測定參考卜丹丹[9]和程浩[10]的方法。分別取0.02，0.06，0.10，0.14，0.18和0.20 mL質量濃度1.0 mg/mL的硫酸鉀標準溶液，加1.0 mol/L鹽酸補體積至0.5 mL，加入3.5 mL 8%三氯乙酸，分別加入1.0 mL明膠氯化鋇溶液和明膠溶液，室溫放置20 min，在360 nm處測其吸光度，以硫酸基含量為橫坐標，明膠氯化鋇溶液與明膠溶液吸光度之差（A1-A2，A1為加氯化鋇-明膠溶液后的吸光度；A2為只加明膠溶液后的吸光度）為縱坐標，制作標準曲線。得到標準曲線線性回歸方程：y=0.310 6x-0.013 6，R2=0.997 3。

取適量樣品于具塞試管，加3 mL濃度為1 mol/L的鹽酸，于100 ℃水浴鍋水解5 h，待其完全水解，冷卻后過濾，取1 mL水解液按照標準曲線制作方法得到（A1-A2），根據標準曲線回歸方程計算硫酸基含量（S），取代度按式（1）計算。

式中：DS為硫酸酯化取代度；S為硫酸基的質量分數，%。

1.3.2 紅棗多糖結構表征

1.3.2.1 單糖組成

采用高效液相色譜法[11]測紅棗多糖各單糖含量。

色譜柱Xtimate C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長250 nm：進樣量20 μL；流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 6.70）∶乙腈=83∶17（V/V）。

標準品的制備：精密稱取適量甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖標準品，加水溶解稀釋至每1 mL各含50 μg的混合標準品。

標準品的衍生：精密稱取250 μL混合標準品，加入250 μL 0.6 mol/L的NaOH溶液和500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇溶液，于70 ℃反應1 h，冷水中冷卻10 min，用0.3 mol/L鹽酸中和，加入1 mL氯仿旋渦1 min，按3 000 r/min離心10 min，取上清液，萃取3次。上清液進樣檢測。

待測樣品水解與衍生過程：精密稱取適量待測樣品于10 mL安培瓶中，加入3 mL 2 mol/L的TFA于10 mL安培瓶中，封管，于120 ℃酸解4 h。取出加入甲醇氮吹揮干剩余的TFA，加3 mL水復溶。精密稱取250 μL多糖水解液，加入250 μL 0.6 mol/L的NaOH溶液和500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇溶液，于70 ℃反應1 h，冷水中冷卻10 min，用0.3 mol/L的鹽酸中和，加入1 mL氯仿旋渦1 min，按3 000 r/min離心10 min，取上清液，萃取3次。上清液進樣檢測。

1.3.2.2 相對分子量的測定

采用凝膠滲透色譜（GPC）法[12]測多糖相對分子量。

色譜柱Waters Ultrahydrogel（7.8 mm×300 mm），柱溫30 ℃，流動相為超純水；流速1 mL/min；進樣量10 μL；檢測器，RID-20示差折光檢測器；標準品，聚乙二醇。

測試方法：將樣品溶于流動相，配制成1 mg/mL溶液，使用0.43 μm濾膜過濾，進樣測試。進樣量10 μL，流速1 mL/min。

1.3.2.3 傅里葉紅外光譜（FTIR）

分別稱取適量羧甲基化修飾前后的紅棗多糖，加入適量KBr粉末研磨均勻，壓片處理，分析4 000～500 cm-1波數下紅外光譜圖。

1.3.2.4 原子力顯微鏡分析

將1 mg多糖溶解在1 mL超純水中，在室溫下連續攪拌4 h。將溶解完全的樣品滴到云母載玻片上，待其干燥，進行測樣。

1.3.2.5 熱重分析

分別稱取10 mg多糖，溫度由室溫升高到800 ℃，進行熱重（TG）分析。橫坐標作為溫度，縱坐標作為質量，繪制熱重曲線。

1.3.2.6 剛果紅試驗

參考胡月[13]的方法。各稱5 mg多糖于6支試管中，分別加2 mL蒸餾水用以溶解完全，加入2 mL濃度80 μmol/L的剛果紅溶液，分別加入2 mL不同濃度（0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mol/L）NaOH溶液，混合體系在室溫下反應25 min后，用紫外分光光度計在200～600 nm范圍內掃描得到最大吸收波長（λmax），橫坐標為NaOH的濃度，縱坐標為最大吸收波長（λmax），繪制曲線。

1.3.3 抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性

配制質量濃度0.04 mg/mL的DPPH溶液和不同質量濃度（1，2，3，4和5 mg/mL）修飾前后紅棗多糖溶液。試管中依次加入2 mL DPPH溶液和2 mL不同濃度的紅棗多糖溶液，搖勻，室溫放置30 min，測定其在517 nm處的吸光度，蒸餾水為空白對照，計算清除率（S，%）[14]。

式中：A1為反應液的吸光度；A2為不加DPPH時多糖液自身的吸光度；A0為空白對照DPPH溶液加蒸餾水的吸光度。

1.3.3.2 ABTS自由基清除活性

準確稱取0.038 4 g ABTS定容到10 mL，準確稱取0.013 4 g過硫酸鉀定容至10 mL，二者按1∶1（V/V）混合，避光保存12 h得到ABTS溶液，稀釋到吸光度為0.7待用。取不同濃度（1，2，3，4和5 mg/mL）紅棗多糖溶液。試管中依次加入2 mL ABTS溶液和2 mL不同濃度的紅棗多糖溶液，搖勻，室溫放置10 min，測定其在734 nm處的吸光度，以無水乙醇為空白對照，計算清除率[15]（S，%）。

式中：A1為反應液的吸光度；A2為不加ABTS時多糖液自身的吸光度。

2 結果與討論

2.1 結構表征

2.1.1 單糖組成

圖2是未修飾紅棗多糖單糖組成液相色譜圖。根據峰面積和出峰時間對比單糖標準品液相色譜圖（圖1），可以確定紅棗多糖由1-甘露糖、2-核糖、3-鼠李糖、4-葡萄糖醛酸、5-半乳糖醛酸、6-葡萄糖、7-半乳糖、8-木糖、9-阿拉伯糖、10-巖藻糖組成，說明紅棗多糖是一類組成復雜、結構多樣的雜多糖[16]。從表1可以得到，紅棗多糖主要是由葡萄糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖組成，占比分別為96.243%，1.269%和1.064%。

圖1 單糖標準品液相色譜圖

圖2 紅棗多糖單糖液相色譜圖

圖3是硫酸酯化修飾的紅棗多糖單糖組成液相色譜圖。由圖3可知，硫酸酯化修飾紅棗多糖主要由10種單糖組成，它們是1-甘露糖、2-核糖、3-鼠李糖、4-葡萄糖醛酸、5-半乳糖醛酸、6-葡萄糖、7-半乳糖、8-木糖、9-阿拉伯糖、10-巖藻糖。由表2得，硫酸酯化修飾的紅棗多糖主要也是由葡萄糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖組成的，只是占比與未修飾的紅棗多糖不同，分別為96.064%，1.426%和0.938%。結合表1和表2，研究發現未修飾的紅棗多糖和硫酸酯化修飾的紅棗多糖單糖組分一樣，只是各自含量不同。

表1 紅棗多糖單糖組成

表2 硫酸化多糖單糖組成

圖3 硫酸酯化紅棗多糖單糖液相色譜圖

2.1.2 相對分子量的測定

圖4是未修飾和硫酸酯化修飾紅棗多糖高效糖凝膠滲透色譜圖。可以看出，紅棗多糖峰比較對稱單一，說明紅棗多糖純度較高，且分子量分布寬度較小，說明均一性較好[17]，多糖的分子量具有相對性，通常所測定的分子量只是一種統計平均值，代表相似鏈長的平均分布。GPC法測得的未經修飾的紅棗多糖的相對分子量為4.865×103Da，硫酸酯化修飾過的紅棗多糖相對分子量為7.426×103Da，這可能是因為硫酸酯化修飾引入硫酸基團，使得紅棗多糖的分子量增大。

圖4 高效凝膠滲透色譜圖

2.1.3 傅里葉紅外光譜分析

圖5為硫酸酯化修飾和未修飾的紅棗多糖在4 000～500 cm-1波長范圍內的光譜圖。3 371.38 cm-1和3 376.70 cm-1是O—H的拉伸振動引起，表明紅棗多糖存在分子內氫鍵。2 921.99 cm-1和2 919.66 cm-1是C—H不對稱伸縮振動引起的[18-19]，1 720.41 cm-1和1 656.53 cm-1是由酯或羧基中C＝O的拉伸振動引起的，表明可能存在糖醛酸或乙酰基[20]。1 411.81 cm-1是對稱C—O拉伸振動和C—H耦合作用引起的，1 155.29 cm-1和1 157.06 cm-1是C—O—H和C—O—C結構產生振動吸收引起的。1 024.14 cm-1和1 029.78 cm-1為—OH的O—H變角振動，919.99 cm-1和921.79 cm-1為α-吡喃糖的吸收峰。852.49 cm-1為β-吡喃糖的吸收峰，由此推測紅棗多糖是α-和β-構型共存的吡喃型甘露糖苷雜多糖[21]。783.05 cm-1和755.95 cm-1是吡喃型特征吸收峰。1 250 cm-1附近是S＝O的不對稱伸縮振動，810 cm-1附近是C—O—S伸縮振動，修飾后—OH特征吸收峰明顯減弱，說明—OH基團被取代。綜上所述，紅棗多糖硫酸酯化修飾成功。

圖5 紅外光譜圖

2.1.4 分子形態學分析

圖6是紅棗多糖原子力顯微鏡圖，a和b是未修飾的紅棗多糖的相圖和3D圖，a1和b1是硫酸酯化修飾多糖的相圖和3D圖。從原子力顯微鏡可以觀察多糖分子形貌、網狀結構、表面粗糙度及黏彈性，球體、隨機線性鏈和帶有分枝和棒狀的隨機鏈是常見的植物多糖構象[22]。如圖6（a）所示，未修飾的紅棗多糖分子排列疏松，顆粒大小不均一，有明顯凸起，表面呈顆粒狀。圖6（a1）中分子排列較密集，顆粒較小且較均一，表面比較平整。圖6（b）和（b1）均呈分支狀，圖6（b1）分支形態大小均一，圖6（b）分支分支不均一，這可能是因為硫酸酯化修飾取代多糖中部分羥基，羥基數目減少，多糖分子間的締合作用減弱，有效降低了多糖的聚合程度，有利于觀察多糖的真實形態[23]。

圖6 原子力顯微鏡

2.1.5 熱重分析

圖7是未修飾和硫酸酯化修飾的紅棗多糖熱穩定性分析曲線。未修飾和硫酸酯化修飾紅棗多糖熱降解過程分4個階段：從室溫分別到175和100 ℃為降解的第1階段，約有9.98%和8.50%的質量損失，主要是由于水分的流失；第2階段是多糖聚合物的降解，初始降解溫度為242和273 ℃，質量損失為22.28%和23.54%；第3階段約為280～450和316～483 ℃，溫度為455和500 ℃時，質量損失率為97.68%和96.56%；在第4階段，隨著溫度增高，2組多糖樣品就形成碳化結構[24]。從熱重分析曲線發現，硫酸酯化修飾的紅棗多糖熱穩定性更好一些，說明硫酸酯化修飾可以提高多糖熱穩定性。

圖7 熱重分析曲線

2.1.6 剛果紅試驗分析

剛果紅是一種酸性染料，可以與含有三螺旋結構的多糖形成絡合物，絡合物的最大吸收波長同剛果紅相比發生紅移，NaOH濃度大于某一數值后，最大吸收波長急劇下降[25]。如圖8所示，隨著NaOH濃度增大，未修飾和硫酸酯化修飾的多糖最大吸收波長都與剛果紅相似，呈現逐漸降低的趨勢，并未發生紅移現象和急劇下降趨勢，所以未修飾和硫酸酯化修飾的多糖都不具備三螺旋結構，硫酸酯化修飾不影響紅棗多糖三螺旋鏈狀結構。

圖8 剛果紅試驗

2.1.7 抗氧化活性測定

圖9顯示紅棗多糖對DPPH自由基的清除能力。隨著濃度的增大，未修飾和硫酸酯化修飾的紅棗多糖對DPPH自由基都有較強的清除作用，并且清除能力隨著多糖濃度的增大而逐漸加強，呈現劑量依賴性。此外，硫酸酯化修飾后的紅棗多糖的清除能力遠高于未修飾多糖，隨多糖濃度的增加，羧甲基化修飾的紅棗多糖對DPPH自由基的清除作用顯著增大。質量濃度為5 mg/mL時，清除率達到84.70%，未修飾的紅棗多糖清除率為53.85%。結果表明，硫酸酯化修飾可以顯著提高紅棗多糖對DPPH自由基的清除作用，這可能是由于新基團硫酸基團的引入，抗氧化活性隨之增大。

圖9 紅棗多糖對DPPH的清除作用

圖10顯示紅棗多糖對ABTS自由基的清除能力。隨著濃度的增大，未修飾和硫酸酯化修飾紅棗多糖對ABTS自由基都有較強的清除作用，并且清除能力隨著多糖濃度增大而逐漸加強，呈現劑量依賴性。硫酸酯化修飾后的紅棗多糖的清除能力遠高于未修飾多糖，隨多糖濃度的增加，硫酸酯化修飾紅棗多糖對ABTS自由基的清除作用顯著增大。質量濃度為4 mg/mL時，清除率達到98.31%，未修飾的紅棗多糖清除率為48.05%。結果表明，硫酸酯化修飾可以顯著提高紅棗多糖對ABTS自由基的清除作用，這可能是因為硫酸酯化修飾，改變了多糖結構，多糖分子量增大，單糖各組分含量發生變化。

圖10 紅棗多糖對ABTS的清除作用

3 結論

紅棗多糖通過三氧化硫-吡啶法，得到取代度較高的硫酸酯化紅棗多糖，通過高效液相色譜法測得未修飾和硫酸酯化修飾后的紅棗多糖都由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖組成，只是含量不同，主要成分都是葡萄糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖，未修飾的占比為96.243%，1.269%和1.064%，硫酸酯化修飾的占比為96.064%，1.426%和0.938%。凝膠滲透色譜法試驗發現，未修飾和修飾后的紅棗多糖相對分子量相差較大，這可能是因為硫酸酯化修飾后，引入硫酸基團，導致其相對分子量發生變化，從而改變其抗氧化活性。紅外光譜分析表明，紅棗多糖硫酸酯化修飾成功，修飾后紅棗多糖的O—H峰明顯減弱。原子力顯微鏡表明，修飾后的紅棗多糖排列較密集，顆粒較小且較均一，表面比較平整。熱重分析說明硫酸酯化修飾可以提高多糖熱穩定性。剛果紅試驗表明未修飾和硫酸酯化修飾的多糖都不具備三螺旋結構，硫酸酯化修飾不影響紅棗多糖三螺旋鏈狀結構。抗氧化試驗表明，硫酸酯化修飾可以顯著提高多糖對DPPH和ABTS自由基的清除率。