黃水芽胞桿菌Bacillus aquiflavi 3H-10全基因組序列分析及功能探究

劉紅強，程坤，于學健，翟磊，鄭佳，姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644000)

濃香型白酒是我國三大基本香型之一，其“窖香濃郁、綿柔甘洌、香味協調”的風格特點深受廣大消費者喜愛，其消費總量占全國白酒的70%左右[1]。濃香型白酒通常以高粱、小麥、玉米等為主要原料，發酵過程中形成的大曲、窖泥和黃水等基質為白酒發酵過程提供了豐富的微生物，主要以芽胞桿菌、乳酸菌、高溫放線菌等微生物為主[2-3]，微生物能夠為白酒發酵過程提供糖化發酵力，是白酒特征風味物質的主要來源。近年來，隨著高通量測序技術和GC-MS技術的不斷發展，解析微生物發酵代謝產物，探究白酒風味與微生物之間的關系，對提高白酒的產量和質量具有重要的意義。

芽胞桿菌屬在白酒發酵過程中含量較多，且在自然界分布較廣，能夠分泌產生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶等酶類物質，較其他微生物具有耐酸、耐乙醇、耐高溫等優點[4-7]。目前，芽胞桿菌的開發和應用主要集中在枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌等菌株[8-10]，針對其他芽胞桿菌的功能性研究相對較少。前期，本實驗室從我國四川省宜賓地區濃香型白酒的黃水樣品中分離到1株新種菌株黃水芽胞桿菌Bacillusaquiflavi3H-10[11]，是我國四川省宜賓地區首株釀酒微生物新種菌株，對于揭示宜賓地區濃香型白酒發酵過程機制具有重要價值。

為探究B.aquiflavi3H-10在白酒發酵過程中的潛在功能特性，本研究基于第二代BGISEQ-500RS測序平臺對菌株進行高通量測序獲得基因組序列，預測其產酶基因及遺傳基礎，并測定菌株產生生物酶的能力、酶活力大小及發酵風味物質，為明晰該菌株在白酒發酵過程中的作用機制及后續大規模生產應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

黃水芽胞桿菌B.aquiflavi3H-10，分離自我國四川省宜賓市五糧液濃香型白酒的黃水樣品，保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)，保藏編號為CICC 24755。

1.1.2 試劑及耗材

福林酚，北京博奧拓達科技有限公司；三氯乙酸，天津市福晨化學試劑廠；酪蛋白，北京欣經科生物技術公司。

1.1.3 培養基

大豆酪蛋白瓊脂(tryptose soya agar,TSA)培養基、大豆酪蛋白液體(tryptose soya broth,TSB)培養基，碧迪醫療器械(上海)有限公司。

蛋白酶培養基(g/L)：KH2PO40.36、Na2HPO41.07、MgSO40.5、CaCl20.02、ZnCl20.14、NaCl 0.16、FeSO40.002、胰蛋白胨0.05、脫脂奶粉10、瓊脂20、pH 6.5，113 ℃滅菌15 min。

淀粉酶培養基(g/L)：糊精20、NaNO33.3、KCl 0.5、K3HPO41.0、FeSO40.01、MgSO45.0、瓊脂 20、pH 6.5，113 ℃滅菌15 min。

纖維素酶培養基(g/L)：羧甲基纖維素鈉5.0、酵母膏0.1、蛋白胨0.5、瓊脂20、pH 5.5～6.0，113 ℃ 滅菌15 min。

酯酶培養基(g/L)：馬鈴薯200、蔗糖20、三丁酸甘油酯4.0、瓊脂20.0、羅丹明B 0.2、pH 6.5，113 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

2000型分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BHG—8082型恒溫培養箱、THZ-98C恒溫振蕩培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；HH-3A水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1B.aquiflavi3H-10發酵液制備

將B.aquiflavi3H-10凍干菌粉溶解后接種于TSA斜面培養基，37 ℃培養72 h得到斜面種子。選取單菌落接種于TSB液體培養基，37 ℃ 180 r/min搖床培養72 h得到發酵液，備用。

1.3.2B.aquiflavi3H-10全基因組測序及生物學分析

利用商業化細菌基因組DNA提取試劑盒(Bacterial DNA Kit，D3350)提取菌株的基因組DNA，利用MGIEasy通用DNA文庫制備試劑套裝構建文庫，將質控合格后的文庫按照BGISEQ-500RS高通量測序試劑套裝(PE100)的操作說明完成上機測序。對下機數據進行過濾質控，去除質量值連續≤20的堿基數達到40%的序列、含N堿基數目>2%的序列和含有接頭和重復序列污染的序列。過濾后的數據利用SPAdes v3.11.0軟件進行多個Kmer參數的拼接，得到最優的組裝結果作為菌株的基因組序列。使用Prodigal v2.6.3軟件進行基因預測，獲得各基因的核酸序列與蛋白質序列。將蛋白質序列與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)[12]、NR(Non-Redundant Protein Sequence Database)[13]和CAZy(The Carbohydrate-Active Enzymes database)[14]數據庫進行比對，預測B.aquiflavi3H-10基因的功能。

1.3.3B.aquiflavi3H-10產生物酶能力分析

利用平板透明圈法對B.aquiflavi3H-10產生物酶的潛力進行初步分析。將滅菌后的濾紙片分別放置于蛋白酶培養基、淀粉酶培養基、纖維素酶培養基和酯酶培養基的平板表面，每個平板上均勻放置3個濾紙片。取1.3.1發酵液20 μL分別接種到濾紙片上，待菌液稍吹干后將平板倒置于37 ℃培養。72 h后取出平板，肉眼觀察蛋白酶培養基平板和酯酶培養基平板的濾紙片周圍有無透明圈出現。在淀粉酶培養基平板和纖維素酶培養基平板中分別倒入5 mL 0.02 mol/L碘液和5 mL 0.2%剛果紅溶液，使溶液均勻覆蓋于培養基表面，放置5～10 min后，觀察濾紙周圍有無透明圈。

1.3.4B.aquiflavi3H-10蛋白酶酶活性測定

將1.3.1中得到的發酵液12 000 r/min，4 ℃，離心5 min，收集上清液，根據GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》的福林酚法測定初始粗酶液的蛋白酶活力。將40 ℃下1 min水解酪蛋白產生l μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位。發酵液蛋白酶活力按公式(1)計算：

(1)

式中：A，由標準曲線得出的樣品最終稀釋液的活力，U/mL；V，溶解樣品所使用的容量瓶體積，mL；4，反應試劑的總體積，mL；n，樣品稀釋的倍數；m，樣品的質量，g；1/10，反應時間10 min，以1 min計。

1.3.5B.aquiflavi3H-10發酵液風味物質測定

取TSA斜面培養基上的單菌落，接種于TSB液體培養基，37 ℃，180 r/min搖床培養72 h得到發酵液。利用GC-MS[15]測定發酵液中的代謝風味產物，分析B.aquiflavi3H-10發酵產生的主體風味。使用未接種菌體的TSB液體培養基作為空白對照。

2 結果分析

2.1 B.aquiflavi 3H-10全基因組概況

利用BGISEQ-500RS高通量測序技術，并通過生物學軟件質控、組裝等分析，獲得B.aquiflavi3H-10的全基因組序列，GenBank登錄號為JAAIWN000000000。組裝得到120條scaffold，基因組大小為3.62 Mb，G+C含量為35.40 mol%，預測3 224個蛋白質編碼基因、79個tRNA基因、14個rRNA基因以及4個其他RNA基因，測序質量良好。菌株B.aquiflavi3H-10基因組與其近緣物種基因組的一般特性相一致[16]，可以用于后續功能基因注釋分析。

2.2 B.aquiflavi 3H-10產蛋白酶相關基因分析

將B.aquiflavi3H-10基因的蛋白質序列與KEGG數據庫和NR數據庫進行比對，結果顯示，共預測到22種編碼蛋白酶的相關基因(表1)。其中，包括1個編碼孢子蛋白酶YyaC的基因，產物具有裂解酸溶性小分子芽胞蛋白的功能[17]；1個受控膜內蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis，RIP)金屬蛋白酶RseP編碼基因和1個位點2蛋白酶家族蛋白，有研究報道，RseP在大腸桿菌中作為位點2蛋白酶的直系同源體，能夠切割跨膜序列、釋放跨膜蛋白信號[18]。此外，還包括與2個扁菱形家族膜內絲氨酸蛋白酶、6個CAAX蛋白酶和細菌素處理蛋白(CAAX proteases and bacteriocin-processing protein，CPBP)家族膜內金屬蛋白酶、2個鋅金屬蛋白酶、7個ATP依賴的LonB、HslV、Clp家族蛋白和2個蛋白質調節劑相關的編碼基因。這些豐富的蛋白酶編碼基因提示，菌株B.aquiflavi3H-10可能具有產生和分泌蛋白酶的潛力。

表1 B.aquiflavi 3H-10蛋白酶相關基因注釋結果Table 1 Annotation result of protease genes in strain B.aquiflavi 3H-10

2.3 B.aquiflavi 3H-10碳水化合物活性酶分析

碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZy)是微生物代謝的重要酶類，在代謝過程中主要發揮降解、修飾及生成糖苷鍵的功能。根據蛋白質結構域中的氨基酸序列相似性，可將CAZy劃分為糖苷水解酶類(glycoside hydrolases, GHs)、糖基轉移酶類(glycosyl transferases, GTs)、多糖裂解酶類(polysaccharide lyases, PLs)、糖水化合物酯酶類(carbohydrate esterases, CEs)、輔助模塊酶類(auxiliary activities, AAs)和碳水化合物結合結構域(carbohydrate-binding modules, CBM)等蛋白質家族，目前被收錄于CAZy數據庫中[14]。通過與CAZy數據庫比對，B.aquiflavi3H-10中共含有17個CAZy(圖1)。

圖1 B.aquiflavi 3H-10中不同類別的CAZy相關基因分布情況Fig.1 Distribution of genes related to CAZy in B.aquiflavi 3H-10

由圖1可以看到，CEs含量較高，所占比例為47.06%；其次依次為GHs、CBMs、GTs，所占比例分別為23.53%、17.65%和11.76%；不含有AAs和PLs。其中，CBMs可以促進酶與底物的結合，克服了水解酶類對不溶性多糖降解效率低的缺點[19]。這些酶類可為美拉德反應提供重要的糖類小分子物質，有助于酯類、纖維素和半纖維素等的酶促降解，因此推測B.aquiflavi3H-10在白酒發酵過程中對底物原料的降解發揮著重要作用。

2.4 B.aquiflavi 3H-10的產酶特性及酶活力

通過觀察平板上的透明圈發現，B.aquiflavi3H-10在蛋白酶培養基平板上可觀察到清晰的透明圈(圖2)，在淀粉酶培養基、纖維素酶培養基和酯酶培養基平板上無明顯的透明圈。由此可見，該菌株具有較強的產生蛋白酶的能力，與其基因組中檢測到多個蛋白酶編碼基因的結果一致。

a-蛋白酶活力；b-纖維素酶活力；c-淀粉酶活力；d-酯酶活力圖2 B.aquiflavi 3H-10酶活力平板測定結果Fig.2 Enzyme activity of B.aquiflavi 3H-10 on plates

按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中福林酚法，測定B.aquiflavi3H-10發酵液的蛋白酶活力為85 U/mL，高于已報道的部分芽胞桿菌(8.82～31.27 U/mL)的蛋白酶活力[20]。在發酵過程中，蛋白酶通過降解蛋白質生成氨基酸等小分子物質，可以促進其他微生物生長代謝，氨基酸與還原糖發生的褐變反應為特征風味物質提供重要的前體物質。考慮到B.aquiflavi3H-10基因組數量較多的蛋白酶編碼基因，推測通過優化發酵條件，菌株產蛋白酶的能力可進一步提升。B.aquiflavi3H-10前期分離自濃香型白酒發酵過程中的黃水基質[11]，其分泌的蛋白酶可以為發酵環境中的美拉德反應提供重要的前體物質，促進濃香型白酒發酵過程中特征風味的生成。

2.5 B.aquiflavi 3H-10的發酵風味物質分析

按照1.3.5的方法，采用GC-MS測定B.aquiflavi3H-10發酵液中的代謝風味物質，與空白對照培養基中的物質比較，定性分析出B.aquiflavi3H-10的發酵代謝物及其產生風味物質的貢獻率。結果顯示，B.aquiflavi3H-10發酵液中共檢測到56種代謝風味物質，與空白對照相比，共有31種物質的含量顯著提高，主要以醇類化合物、酯類化合物和酮類化合物為主，這些風味物質與白酒中的呈香化合物基本一致[15,21]。其中，相對含量最高的5種成分依次是苯甲醛(杏仁香，堅果香)、2,5-二甲基吡嗪(炒芝麻香)、正丁醇(水果香)、3-甲基己醇和己酸乙酯。己酸乙酯是濃香型大曲酒的主體香味物質[15]，也是葡萄酒中的重要香氣成分[22]，可賦予酒體甜香、水果香、窖香和青瓜香等味道。苯甲醛具有杏仁香和堅果香，已報道其對黃酒等傳統發酵酒類獨特風味的形成有重要貢獻[23]。2,5-二甲基吡嗪和正丁醇可分別使酒體呈現炒芝麻香和水果香[22,24]。除此之外，B.aquiflavi3H-10還可發酵產生異丁酸乙酯(花香，蘋果香，水蜜桃香，水果香)、2-丁酮(焦糖)和三甲基吡嗪(濃厚的堅果香氣)等風味物質。由此可見，B.aquiflavi3H-10可發酵產生豐富的風味物質，有助于濃香型白酒主體風味物質的形成，并可賦予酒體多種獨特的風味。因此，B.aquiflavi3H-10對濃香型白酒發酵過程具有較大應用潛力。

表2 B.aquiflavi 3H-10發酵液風味物質檢測結果Table 2 Flavor compounds detected in the fermentation liquid of B.aquiflavi 3H-10

3 結論

本研究對我國四川省宜賓地區首株釀酒微生物新種黃水芽胞桿菌B.aquiflavi3H-10[11]進行全基因組測序，通過與數據庫比對分析潛在功能基因，并利用平板透明圈法、福林酚法和GC-MS技術研究其產生物酶特性、酶活力和發酵風味物質。基因分析顯示，菌株B.aquiflavi3H-10基因組中含有編碼22種蛋白酶和多種碳水化合物酶類的基因，具有產生蛋白酶和碳水化合物的潛力。試驗結果顯示，菌株B.aquiflavi3H-10在蛋白酶培養基平板上透明圈較明顯，蛋白酶酶活力可達85 U/mL，并可產生56種代謝風味化合物，包括酯類、醇類、芳香族、羰基化合物、雜環化合物等，其中，苯甲醛(杏仁香，堅果香)、2,5-二甲基吡嗪(炒芝麻香)、正丁醇(水果香)、3-甲基己醇和濃香型大曲酒的主體香味物質的物質己酸乙酯(甜香，水果香，窖香，青瓜香)等成分相對含量較高。研究表明，黃水芽胞桿菌B.aquiflavi3H-10具有顯著的產蛋白酶能力，發酵產生濃香型白酒具有的特征風味物質，推測其在白酒發酵過程中具有潛在應用價值。芽胞桿菌作為重要功能菌株，在白酒發酵過程具有較好的應用潛力，后續有待進一步解析B.aquiflavi3H-10在安全性和抗逆性等方面的特性，為該菌株的大規模開發利用提供前期研究基礎。