基于網絡藥理學和細胞實驗探討小檗堿治療肺癌的作用機制

鄒宇翔 柳 鑫 李 為▲

1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部，湖北武漢 430030；2.武漢市第四醫院藥學部，湖北武漢 430033

肺癌是世界重大公共衛生問題，其發病率與病死率均占惡性腫瘤的首位，全球范圍內的肺癌中有80%～85%被歸為非小細胞肺癌，臨床治療主要采用手術、化學療法和放射療法等[1]?；瘜W藥物和分子靶向藥物的臨床應用大大延長了晚期肺癌患者的生存期并改善其生活質量[2]，然而長期使用會產生耐藥性問題，因此，尋找新的治療肺癌有效藥物成為科學研究的重要方向[3-4]。小檗堿是中藥黃連發揮臨床療效的重要活性成分。研究發現，小檗堿具有抗腫瘤、抗菌和調節血糖等作用[5-8]，然而其治療肺癌的機制尚不清楚。本研究采用網絡藥理學探究其治療肺癌的潛在作用機制并進行初步的實驗驗證，以期為臨床使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞

人非小細胞肺腺癌細胞A549，由武漢大學中國典型培養物保藏中心提供。

1.2 藥物與試劑

小檗堿（成都格利普，批號：2086-83-1），經高效液相色譜（HPLC）分析含量為99.3%；細胞計數試劑法（CCK-8，日本同仁，CK04）；RPMI1640（Gibco，YS-R1018）；胎牛血清（Ausbian，VS500T/WS500T）；缺口末端標記法（TUNEL）試劑盒（Vazyme，A113-03）；p53抗體（AffinityBF8013）、Bax抗體（Affinity，AF0120）、Bcl-2抗體（Affinity，AF6139）。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱（上海海向，CHW-80L）；電子天平（廣東鼎恒，ME104）；高壓滅菌鍋（上海博迅，YXQ-50SII）；酶標儀（BIOBASE，FC）；電泳儀（北京六一，DYY-7C）。

1.4 方法

1.4.1 藥物和疾病靶點的獲取和網絡構建 從PubChem數據庫中獲取小檗堿結構式，導入Swiss TargetPrediction數據庫預測化合物的靶點。在Genecards數據庫，以“lung cancer”為關鍵詞，獲取肺癌的靶點，導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建化合物-疾病靶點（C-T）圖和“化合物-靶點－疾病”（C-T-P）圖。將潛在靶點導入STRING數據庫，設定物種為“智人（homo sapiens）”，構建蛋白互作（PPI）關系網絡。

1.4.2 基因本體功能（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將上述靶基因導入DAVID 6.8數據庫，設定物種為“homo sapiens”，進行GO富集分析和KEGG信號通路分析，將數據可視化。

1.4.3 CCK-8檢測小檗堿對A549細胞增殖的抑制作用 人非小細胞肺腺癌A549采用10%血清培養，取對數生長期細胞，接種后于37℃、5%的CO2培養箱中孵育，貼壁后按實驗方案操作。將A549細胞以7000個/孔接種于96孔板中，貼壁后，加入小檗堿，濃度設置為0、1、2、4、8、10、20和40 μg/ml，每組3個復孔。CCK8法檢測作用12、24、48 h后細胞的存活率。將酶標儀設置于波長450 nm，測量各孔的吸光度（OD）值，計算細胞存活率。

1.4.4 TUNEL法檢測小檗堿對A549細胞凋亡作用 將爬好細胞的玻片固定后，按要求進行操作，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4.5 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測A549細胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白表達水平 細胞接種到6孔板中，分別根據上述結果按要求在各孔加入相應試劑，作用24 h后，棄上清液。用PBS清洗后，提取總蛋白，檢測各組細胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白表達水平。

1.5 統計學處理

采用SPSS 26.0統計學軟件進行分析，數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 化合物-靶點-疾病的網絡構建

從數據庫中共獲取化合物靶點100個和疾病靶點23469個，得到潛在靶點92個，構建C-T圖。將交集靶點和化合物與疾病等導入Cytoscape 3.7.2軟件構建C-T-P圖。見圖1～2。

圖1 C-T圖

圖2 C-T-P圖

2.2 構建PPI蛋白網絡

將92個潛在靶點導入STRING數據庫，得到PPI網絡。并將其導入Cytoscape 3.7.2軟件，度值高的靶點有SRC、CDC42、CDK4、CDK2、CHEK1等，推測可能是小檗堿治療肺癌過程中發揮作用的關鍵靶點。見圖3。

圖3 蛋白-蛋白互作網絡圖

2.3 靶點富集分析

2.3.1 GO功能富集分析 將篩選出的92個潛在靶點導入DAVID 6.8數據庫進行GO富集分析，以P＜0.05為閾值，以Count值為標準排序。生物學過程（biological process，BP）涉及蛋白質磷酸化、信號傳導和藥物反應等；細胞組分（cellular component，CC）涉及質膜、胞漿和核質等；分子功能（molecular function，MF）涉及蛋白質結合、ATP結合、蛋白激酶活性等。見圖4。

圖4 GO功能富集分析

2.3.2 KEGG通路富集分析 通過KEGG通路富集，分析靶標信號通路，以P＜ 0.01為閾值，以Count值為標準排序，相關通路包括細胞生長、分化、凋亡等。為進一步探究小檗堿與凋亡生理過程的關聯性，挑選出富集程度和凋亡過程相關度較高的通路，包括P53等信號通路，構建化合物-靶點-通路關系。見圖5～6。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 化合物-靶點-通路分析

2.4 小檗堿對A549細胞增殖的抑制作用

與空白組（小檗堿濃度為0 μg/ml）比較，小檗堿干預12 h后，濃度大于10 μg/ml時A549細胞存活率顯著降低（P＜0.01）；干預24 h后，濃度大于2 μg/ml時A549細胞存活率顯著降低（P＜ 0.01），其IC50值約為8.51 μg/ml；干預48 h后，除空白組外，各濃度小檗堿作用于A549細胞后存活率顯著降低（P＜ 0.01），提示小檗堿對A549細胞具有顯著的增殖抑制作用。見表1。綜合考慮選擇小檗堿作用時間為24 h，作用濃度為4、8和10 μg/ml開展后續試驗。

表1 小檗堿對A549細胞存活率的影響（%，±s）

表1 小檗堿對A549細胞存活率的影響（%，±s）

注 與空白組（0 μg/ml）比較，**P ＜ 0.01

干預時間 n 0 μg/ml 1 μg/ml 2 μg/ml 4 μg/ml 8 μg/ml 10 μg/ml 20 μg/ml 40 μg/ml 12 h 3 100.00±0.00 96.80±5.10 94.75±2.72 94.91±10.55 95.32±9.10 93.90±3.06 80.05±2.30** 63.41±1.45**24 h 3 100.00±0.00 99.31±1.41 100.95±5.23 89.45±5.65** 69.87±2.19** 55.47±0.86** 31.39±1.92** 23.14±0.68**48 h 3 100.00±0.00 85.12±0.60** 75.04±4.90**53.36±4.90** 47.67±3.02**28.767±1.15** 16.94±2.18** 18.53±0.71**

2.5 小檗堿對A549細胞凋亡的作用

TUNEL結果顯示，與空白組比較，小檗堿濃度為4、8和10 μg/ml時，均能顯著促進A549細胞的凋亡，且細胞凋亡促進作用與小檗堿的干預濃度相關。見圖7。

圖7 TUNEL法檢測A549細胞凋亡（400×，熒光顯微鏡下組織切片上凋亡的細胞呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光）

2.6 p53、Bax和Bcl-2的蛋白表達水平

結果顯示，隨著小檗堿干預濃度的增大，p53和Bax蛋白的表達水平上調，Bcl-2蛋白的表達水平下調，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。見圖8和表2。

圖8 Western blotting法檢測A549細胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白的表達

表2 Western blotting法檢測A549細胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白的相對表達水平（±s）

表2 Western blotting法檢測A549細胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白的相對表達水平（±s）

注 與空白組（0 μg/ml）比較，**P ＜ 0.01

濃度（μg/ml） n p53/GAPDH Bax/GAPDH Bcl-2/GAPDH 03 0.19±0.01 0.18±0.01 0.54±0.0143 0.42±0.01** 0.31±0.01** 0.40±0.02**83 0.56±0.01** 0.37±0.04** 0.29±0.02**10 3 0.72±0.01** 0.61±0.01** 0.11±0.02**

3 討論

研究報道，中醫藥治療腫瘤在改善癥狀、提高生活質量、延長生存期和縮小腫瘤大小方面作用明顯[9]。中醫藥與西藥配合使用能起到減毒增效的作用，是我國創新性新藥研制的重要方向，也是藥物研發的熱點[10-11]。中醫藥治療肝癌作用機制比較廣泛，抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡是其中重要的治療途徑[12-13]。本研究通過網絡藥理學分析發現小檗堿涉及抗腫瘤和細胞凋亡等生理過程，提示其抑制腫瘤的作用機制可能與細胞凋亡有關。實驗證實小檗堿對A549細胞的增殖具有明顯的抑制作用，且作用與濃度成正比。p53蛋白是細胞正常運行所必需的調節因子，是細胞凋亡的關鍵蛋白[14-15]。進一步研究提示，小檗堿能夠通過上調p53和Bax蛋白，下調Bcl-2蛋白的表達水平，從而起到促進細胞凋亡的作用，驗證了網絡藥理學分析結果，為小檗堿的抗腫瘤研究提供了實驗依據，有進一步研究的重要價值。然而該研究僅在細胞水平，具有一定的局限性，期待在體內研究中出現更高級別證據，完善研究結論。