基于多數(shù)據(jù)庫篩選胃癌的自噬相關(guān)基因及預(yù)后預(yù)測模型的建立

羅志鵬 苗志國 金瑞日 魏海云

1.江西省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科，江西南昌 330029；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西南昌 330006

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，首診多為進(jìn)展期，預(yù)后較差，且生存期短[1]。胃癌個體差異大，同一分期預(yù)后也不盡相同，目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物不能準(zhǔn)確反映患者預(yù)后，尋找更多的生物標(biāo)志物來協(xié)助預(yù)測胃癌患者預(yù)后具有重要意義。自噬是通過與溶酶體融合吞噬分解細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器，達(dá)到細(xì)胞代謝及更新細(xì)胞器的目的[2]，為體內(nèi)重要的生物學(xué)過程，研究顯示很多腫瘤的病理過程中都有自噬參與[3-4]。自噬還可能和腫瘤耐藥有關(guān)[5]，因此進(jìn)一步明確自噬在腫瘤中的作用對提高腫瘤的診療水平有較大的幫助。目前，基于自噬相關(guān)基因（autophagy relative genes，ARGs）構(gòu)建的預(yù)后模型已經(jīng)應(yīng)用于多種癌癥[6-7]，但關(guān)于胃癌ARGs預(yù)后模型仍較少。本研究通過多種數(shù)據(jù)庫篩選得到胃癌ARGs，并應(yīng)用COX及Lasso分析得到與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵ARGs，建立預(yù)后預(yù)測模型，為胃癌患者提供新的預(yù)后預(yù)測方法。

1 資料與方法

1.1 篩選人類ARGs集

從人類自噬數(shù)據(jù)庫（HADb，http: //autophagy. lu/clustering/index.html）和GSEA分子特征數(shù)據(jù)庫（MSigDB，http//software. broadinstitute.org/gsea/msigdb）中獲得805個ARGs。

1.2 原始資料的下載與整理

下載腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（TCGA，https: //portal.gdc.cancer.gov/）中STAD格 式 的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)。共有407個胃癌樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。胃癌患者的臨床信息使用R語言軟件的“TCGAbiolinks”包獲得.應(yīng)用R語言軟件通過GEOquery包從gene expression omnibus數(shù) 據(jù) 庫（GEO，https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載GSE54129數(shù)據(jù)。剔除無預(yù)后信息患者的數(shù)據(jù)。

1.3 胃癌差異ARGs的篩選及GO功能和KEGG分析

應(yīng)用通過GEOquery包從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE54129，總共有132例樣本，分為正常胃組織（21例）和胃癌組織（111例）。通過箱式圖查看樣本標(biāo)準(zhǔn)化的情況，通過PCA圖以及UMAP圖查看樣本分組間聚類情況，利用limma包進(jìn)行兩組的差異分析。獲取的差異基因與自噬相關(guān)基因取交集，進(jìn)行進(jìn)一步分析。利用R軟件的“clusterprofiler”“org.HS.eg.7db”包進(jìn)行基因組本體（GO）功能富集解析（生物學(xué)步驟、細(xì)胞成分和分子作用）。利用日本京都基因百科全書（KEGG）分析可能有關(guān)的信號通路。

1.4 胃癌患者預(yù)后相關(guān)關(guān)鍵基因的篩選

利用Lasso回歸分析獲取與胃癌患者預(yù)后相關(guān)性更高的ARGs結(jié)果。將標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)不為零的基因組再納入多因素COX分析，從而形成了最終的預(yù)后風(fēng)險評價模式。獲取與患者預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵ARGs，并通過Lasso回歸的風(fēng)險因子數(shù)據(jù)，使用R軟件繪制風(fēng)險因子圖像。將胃癌患者的生命信號和不同表達(dá)的自噬差異基因整合到一起。同時對篩選出的基因進(jìn)行KM生存曲線分析。

1.5 列線圖的開發(fā)和評估

基于多因素COX回歸分析結(jié)果篩選出獨(dú)立的預(yù)后參數(shù)用于建立列線圖，rms包和survival包估計(jì)1、3、5年內(nèi)總生存期（overall survival，OS）概率，并繪制校準(zhǔn)曲線，以評價模型的可行性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計(jì)算生存率，采用Log-Rank方法比較患者的生存狀況。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲取胃癌組織差異表達(dá)ARGs

比較GSE54129數(shù)據(jù)中，正常組織（21例）和胃癌組織（111例）的基因表達(dá)，得到2583個差異表達(dá)的基因，其中有1134個基因在胃癌組織中高表達(dá)，1449個基因在胃癌中低表達(dá)。差異基因與805個自噬基因相交集，獲得102個自噬基因和胃癌相關(guān)，見圖1。

圖1 胃癌ARGs韋恩圖

2.2 差異表達(dá)的胃癌ARGs GO功能富集和KEGG信號通路分析

通過GO功能富集和KEGG信號通路分析得出ARGs可能和以下基因集有關(guān)，見表1。

表1 差異表達(dá)的胃癌ARGs GO功能富集和KEGG信號通路分析

2.3 胃癌ARGs的篩選結(jié)果

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，通過Lasso回歸分析102個ARGs（篩 選 條 件為Lasso_coef＞0）發(fā) 現(xiàn)CXCR4、DYNC1I1、RNASE1、SERPINE1可能與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)，見圖2。

圖2 Lasso篩選胃癌ARGs和交叉驗(yàn)證結(jié)果

2.4 胃癌關(guān)鍵ARGs的篩選

通過多因素COX回歸分析篩出DYNC1I1、RNASE1兩個風(fēng)險基因（P＜ 0.05），見表2；篩選出基因低表達(dá)的患者較高表達(dá)患者具有更長的生存期，見圖3。模型有相對較好的預(yù)測能力。

表2 多因素COX回歸分析

圖3 DYNC1I1、RNASE1生存曲線分析

2.5 胃癌預(yù)后模型可靠性評估

根據(jù)諾莫列線圖得出的C值越接近1，說明列線圖的預(yù)測能力越準(zhǔn)確，見圖4。本研究構(gòu)建的預(yù)測模型C值為0.68，表示該模型具有較好的預(yù)測能力。通過分析DYNC1I1、RNASE1預(yù)后相關(guān)列線圖和列線圖的內(nèi)部校正曲線，可以看出術(shù)后1、3年具有較好的預(yù)測效果，術(shù)后5年的效果略差，可能與胃癌術(shù)后5年生存期偏低，樣本量較少有關(guān)，見圖5。

圖4 構(gòu)建胃癌獨(dú)立危險因素列線圖模型

圖5 術(shù)后1、3、5年OS的預(yù)后列線圖校準(zhǔn)曲線對模型預(yù)測準(zhǔn)確性進(jìn)行評價

3 討論

進(jìn)展期胃癌治療效果差，盡管阿帕替尼、曲妥珠單抗及程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）等治療手段可以使部分患者生存期延長，但胃癌總體生存期仍處于較低水平[8-10]。目前鉑類仍是胃癌的一線治療用藥，鉑耐藥是胃癌治療效果較差的一個重要因素，在其他癌癥中發(fā)現(xiàn)鉑耐藥可能與自噬有關(guān)[11]。自噬影響胃癌預(yù)后的作用機(jī)制值得探究。基于ARGs表達(dá)的預(yù)后模型現(xiàn)已應(yīng)用于肺癌、膽管癌、腸癌、乳腺癌等[12-14]。但在胃癌中的應(yīng)用較少，本研究通過多種數(shù)據(jù)庫篩選得到102個胃癌ARGs，利用GO功能富集，KEGG進(jìn)行信號通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的ARGs主要和自噬、阿米巴病、p53信號通路、癌癥中的蛋白多糖、糖尿病代謝中的Age-rage通路等相關(guān)。應(yīng)用Lasso回歸模型分析篩選出4個ARGs可能與胃癌預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步使用多變量COX比例風(fēng)險回歸分析，得到DYNC1I1、RNASE1兩個基因，建立了胃癌預(yù)后ARGs風(fēng)險預(yù)測模型，提示DYNC1I1、RNASE1與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)，并分析了其對胃癌患者術(shù)后1、3、5年生存期的影響，其中術(shù)后1、3年具有較好的預(yù)測效果，術(shù)后5年的效果略差，可能與胃癌術(shù)后5年生存期偏低，樣本量較少有關(guān)。

目前對于DYNC1I1在腫瘤中的作用研究較多，其可能參與了腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡、鉑耐藥等生物學(xué)過程。DYNC1I1可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡；DYNC1I1通過上調(diào)白介素-6的表達(dá)促進(jìn)胃癌的增殖和遷移[15-16]，Zhou等[17]認(rèn)為DYNC1I1可以作為肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。RNASE1同樣參與了很多病理過程，Cabrera-Fuentes等[18]認(rèn)為RNASE1可以防止細(xì)胞外RNA和腫瘤壞死因子-α在心肌缺血、再灌注損傷中的相互破壞作用;對心肌缺血具有保護(hù)作用；雖然RNASE1在腫瘤中的研究較少，但馬平川等[19]在其RNA結(jié)合蛋白相關(guān)預(yù)后模型的建立中提示RNASE1對于胃癌預(yù)后有較好的預(yù)測效果。Peracaula等[20]報道RNASE1對于早期胰腺癌也有提示作用。目前對于這些ARGs在胃癌中的作用仍然了解有限，自噬如何影響胃癌預(yù)后的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過篩選胃癌ARGs，本研究成功構(gòu)建了基于DYNC1I1、RNASE1的胃癌預(yù)后預(yù)測模型，該模型具有較好的預(yù)測能力。對于提高臨床預(yù)后，尋找新的治療靶點(diǎn)有一定的參考意義。