糖尿病對肺結核菌株表型耐藥及基因突變影響的前瞻性研究

張瑛梅，王飛，任小兵，王玥蓮，陳俊，胡瑩，胡曉勤，徐文革*

我國是結核病和糖尿病高負擔國家［1］，耐藥結核病（drug resistant tuberculosis，DR-TB）是當前全球健康的一個嚴重威脅，其發(fā)病率、病死率高，治療復雜，花費巨大［2］，是人類戰(zhàn)勝結核病的重大阻礙。臨床上糖尿病合并肺結核很常見。近年來，國內(nèi)外在糖尿病對肺結核耐藥率、療效差異、復發(fā)率等方面有一些臨床研究，但結論并不統(tǒng)一［3-4］。有研究發(fā)現(xiàn)合并糖尿病的肺結核（DM-PTB）比單純肺結核（PTB）有更高的異煙肼耐藥率，但利福平耐藥無差異［5］，也有研究表明DM-PTB的耐藥率與PTB無差異［6］。國外有研究發(fā)現(xiàn)DM-PTB患者異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的耐藥率較高，相較于PTB更有可能出現(xiàn)耐多藥結核病［7］。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，既往研究多以回顧性研究為主，糖尿病對肺結核菌株表型耐藥、基因突變影響的前瞻性對比研究尚少。為進一步探究糖尿病對肺結核耐藥的影響，本研究前瞻性地對DM-PTB及PTB患者進行表型耐藥、基因突變檢測，旨在為后續(xù)研究提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018—2020年在簡陽市人民醫(yī)院就診的結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的肺結核患者357例，根據(jù)是否合并糖尿病，將其分為PTB組216例和DMPTB組141例。本研究通過簡陽市人民醫(yī)院倫理委員會倫理審核〔編號：（2018）19〕，已在中國臨床試驗注冊中心注冊，注冊號：ChiCTR2000039148。

1.2 納入與排除標準 納入標準：符合《肺結核診斷：WS 288—2017》中的涂片陽性肺結核診斷標準［8］；符合《中國慢性疾病防治基層醫(yī)生診療手冊（糖尿病分冊）2015年版》中的糖尿病診斷標準［9］：有糖尿病典型癥狀，空腹靜脈血糖＞7.0 mmol/L，隨機或空腹葡萄糖耐量試驗（OGTT）2 h靜脈血糖＞11.1 mmol/L；若無癥狀，需非同日2次檢測明確。排除標準：菌種鑒定為非結核分枝桿菌。

1.3 材料與方法 試劑及設備：結核分枝桿菌菌種鑒定采用美國BD公司BACTEC MGIT960 System全自動分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)。采用異煙肼、乙胺丁醇、利福平、鏈霉素藥敏試劑盒（熒光法）進行表型藥物敏感試驗（簡稱：藥敏試驗）。分子檢測試劑：結核分枝桿菌耐藥基因突變檢測試劑盒（PCR-反向點雜交法），由亞能生物技術（深圳）有限公司提供；伯樂基因擴增儀（儀器型號S1000）。

1.4 試驗方法 從門診、住院的患者中篩查痰抗酸染色陽性患者，記錄患者年齡、性別、是否合并糖尿病，取晨痰送結核分枝桿菌培養(yǎng)進行菌株鑒定。培養(yǎng)為陽性且鑒定為結核分枝桿菌的標本繼續(xù)進行藥敏試驗。PTB組隨機抽樣選擇62例、DM-PTB組隨機選擇61例進行耐藥基因位點突變檢測，檢測位點包括異煙肼inhA基因-15位堿基、KatG基因315位氨基酸；利福平rpoB基因RRDR區(qū)、rpoB基因516位氨基酸、rpoB基因526位氨基酸、rpoB基因531位氨基酸；乙胺丁醇embB基因306位氨基酸；鏈霉素rpsL基因43位氨基酸、rpsL基因88位氨基酸。

1.5 耐藥定義 根據(jù)《耐藥結核病化學治療指南（2019年簡版）》［10］定義，單耐藥結核病：結核病患者感染的結核分枝桿菌經(jīng)體外藥敏試驗被證實對一種一線抗結核藥物耐藥。多耐藥結核病：結核病患者感染的結核分枝桿菌經(jīng)體外藥敏試驗被證實對一種以上一線抗結核藥物耐藥（但不包括同時對異煙肼、利福平耐藥）。耐多藥結核病（MDR-TB）：結核病患者感染的結核分枝桿菌經(jīng)體外藥敏試驗被證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料進行正態(tài)分布檢驗，偏態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 患者入組流程見圖1。PTB組男162例，女54例；中位年齡52（34，65）歲。DM-PTB組男124例，女17例；中位年齡53（39，61）歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=-1.78，P=0.07）。兩組性別比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.97，P=0.003）。

圖1 患者入組流程圖Figure 1 Flowchart of participants enrollment

2.2 抗結核藥耐藥及基因位點突變情況

2.2.1 一線藥物耐藥結果 兩組利福平、乙胺丁醇、鏈霉素耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；DM-PTB組異煙肼耐藥率高于PTB組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 PTB組和DM-PTB組患者一線抗結核藥物耐藥率比較〔n（%）〕Table 1 First-line drug-resistant profile between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.2 不同類型耐藥結果 兩組患者異煙肼、利福平、鏈霉素單耐藥率以及多耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；DM-PTB組耐多藥率高于PTB組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 PTB組和DM-PTB組患者不同類型耐藥情況比較〔n（%）〕Table 2 Different types of drug resistance between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.3 檢測基因位點突變結果 兩組患者檢測基因位點突變率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 PTB組和DM-PTB組患者檢測基因位點突變率比較〔n（%）〕Table 3 Rate of mutation at the gene loci between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.4 一線抗結核藥耐藥基因位點突變分布 PTB組異煙肼耐藥位點均為KatG基因315位氨基酸S315T/N位點突變5例（5/5）；利福平耐藥位點為rpoB基因RRDR區(qū)6例（6/15），rpoB基因526位氨基酸H526D位點突變4例（4/15），rpoB基因531位氨基酸S531L位點突變5例（5/15）；鏈霉素耐藥位點rpsL基因43位氨基酸K43R位點突變2例（2/3），rpsL基因88位氨基酸K88R位點突變1例（1/3）。

DM-PTB組異煙肼耐藥位點均為KatG基因315位氨基酸S315T/N位點突變7例（7/7）；利福平耐藥位點為rpB基因RRDR區(qū)3例（3/5），rpoB基因531位氨基酸S531L位點突變2例（2/5）；乙胺丁醇耐藥位點為embB基因306位氨基酸M306L/V位點突變1例（1/1）。

3 討論

世界衛(wèi)生組織指出，糖尿病是結核病發(fā)生的重要風險因素［1］。免疫和激素的變化、不同細胞因子的產(chǎn)生、微生物群的改變、內(nèi)皮功能障礙和維生素D缺乏是導致2型糖尿病和肺結核共病的主要因素［11］。合并糖尿病同樣也會增加耐藥風險，國內(nèi)一項納入13項研究、33 747例患者的Meta分析結果顯示，在新診斷的結核病患者中，糖尿病與異煙肼耐藥性顯著相關〔RR=1.22，95%CI（1.04，1.43）〕［12］。另一項研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病程≥5年是發(fā)生耐多藥的危險因素（OR=19.469，P=0.015）［13］。糖尿病和結核病重疊可能會對全球結核病防控工作產(chǎn)生不利影響［14］，國外研究也證實合并糖尿病的新發(fā)結核病患者耐藥風險增加［15］。糖化血紅蛋白（HbA1c）＜7%的DM-PTB患者發(fā)生利福平耐藥、異煙肼耐藥和耐多藥風險更低［16］。本研究通過對PTB組患者及DM-PTB組患者進行前瞻性的基因突變、表型耐藥檢測，證實糖尿病會提高肺結核的異煙肼耐藥率及耐多藥率，但是對利福平、乙胺丁醇、鏈霉素的耐藥率無差異。

結核分枝桿菌耐藥的主要原因是基因突變［15］，已有研究證實結核分枝桿菌耐利福平rboB基因位點突變主要與531位點、526位點高度相關，耐異煙肼katG315位點、inhA基因-15位點突變與異煙肼耐藥高度相關，提示利福平和異煙肼敏感性的基因型與這些藥物的表型耐藥性高度相關［17］。katG、rpoB、rpsL基因突變檢測能有效預測異煙肼、利福平、鏈霉素耐藥［18］。本研究選擇inhA基因-15位堿基、KatG基因315位氨基酸、rpoB基因RRDR區(qū)、rpoB基因516位氨基酸、rpoB基因526位氨基酸、rpoB基因531位氨基酸、embB基因306位氨基酸、rpsL基因43位氨基酸、rpsL基因88位氨基酸能有效預測異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素一線藥物的耐藥。通過研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼突變率第1位的基因位點為：katG315，與前期研究結果一致［19］。同時研究發(fā)現(xiàn)無論是PTB還是DM-PTB患者，均以KatG基因315位氨基酸為主，突變類型為S315T/N。利福平耐藥位點突變分布有一定差別，DM-PTB患者利福平耐藥位點主要為rpoB基因RRDR區(qū)、rpoB基因531位氨基酸，耐藥位點與徐小溪等［20］研究相似。本研究PTB患者耐藥位點除上述位點外，還發(fā)現(xiàn)有rpoB基因526位氨基酸突變，提示利福平耐藥位點突變可能存在多態(tài)性。乙胺丁醇耐藥相關基因突變以embB基因306位氨基酸突變?yōu)橹鳎蛔冾愋蜑镸306L/V。鏈霉素耐藥相關基因突變主要以rpsL基因43位氨基酸K43R位點突變?yōu)橹鳌１狙芯拷Y果提示PTB患者及DM-PTB患者之間各一線抗結核藥物相關耐藥基因位點突變分布及突變率無統(tǒng)計學差異，這與國內(nèi)其他研究有一定區(qū)別［5］。

本研究進行了以藥敏試驗作為結果的表型耐藥研究及以基因位點突變結果的耐藥位點研究，發(fā)現(xiàn)簡陽地區(qū)的耐藥率與其他地方的檢測結果有一定差異［21］。這與地域差異及醫(yī)療分布有關，簡陽市人民醫(yī)院作為縣級市三甲醫(yī)院，主要收治來自基層初篩懷疑結核的患者，患者主要以初治結核為主。另外，從培養(yǎng)和基因檢測結果對比發(fā)現(xiàn)，基因位點突變與表型耐藥之間并不完全對等，本研究檢測的位點突變率低于藥敏試驗結果，這可能與基因檢測樣本相對偏少有關，也可能提示表型耐藥的患者不一定伴隨相應藥物耐藥位點的突變。臨床的最終治療應以藥物敏感試驗結果為準，同時需密切觀察患者抗結核治療后的應答情況。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，DM-PTB患者中男性所占比例較高，與吳桂輝等［22］、李雪等［23］研究相似，提示應該重視男性糖尿病群體中肺結核的排查以及男性肺結核患者中糖尿病的篩查。

綜上所述，本研究證實糖尿病會加重肺結核患者異煙肼耐藥及耐多藥情況的出現(xiàn)，從而加重耐藥結核負擔。臨床工作中應該加強對DM-PTB患者的耐藥篩查，尤其是抗結核治療效果欠佳的患者，同時要強化血糖的控制。

本研究也存在一些不足之處：入組患者多為初治患者，但也有個別是再發(fā)、復治患者，未進行區(qū)分，結果可能會有一定偏倚，可以在以后更大樣本量的研究中優(yōu)化。另外，本研究嘗試通過基因位點突變間的差異探索對于糖尿病影響異煙肼耐藥的具體機制，但未發(fā)現(xiàn)兩組患者基因位點間存在差異，考慮可能與基因位點監(jiān)測樣本偏少，得出的耐藥數(shù)量、耐藥率相對偏低有一定關系。以上不足與未探明的機制也將是下一步研究的重點。

作者貢獻：張瑛梅提出研究思路、設計研究方案、負責數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計學分析、繪制圖表、論文起草以及最終版本修訂，對論文負責；王飛設計研究方案、進行論文的修訂；任小兵負責文章修改；王玥蓮負責數(shù)據(jù)收集；陳俊、胡瑩、胡曉勤負責樣本的采集；徐文革負責最終版本修訂，對論文負責。

本文無利益沖突。