咪唑類表面活性劑與β-乳球蛋白相互作用研究

耿斐

(山東建筑大學 學報編輯部，山東 濟南250101)

0 引言

蛋白質是生物體形態(tài)結構和生命活動依賴的物質基礎，是一切生物體的重要組成成分，在生命的新陳代謝和自我復制過程中起著極其重要的作用[1]。蛋白質是一類兩性物質，可以與包括表面活性劑[2-3]、藥物[4-5]、染料[6-7]以及金屬離子[8-9]等在內的許多種類的小分子結合。 蛋白質的功能是由特定的三維空間結構決定的，與小分子的相互作用會引起其分子中各級結構的變化，導致其化學性質的變化和生物活性的喪失，最嚴重的還會引起變性。

乳清蛋白是一種重要的食品添加劑，已廣泛應用于乳制品、肉制品和糕點等不同的領域。 β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)是由乳腺上皮細胞合成的乳蛋白， 是主要的乳清蛋白之一[10]。JELIN′SKA 等[11]應 用 泰 勒 分 散 分 析( Taylor Dispersion Analysis，TDA)研究了陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉對β-乳球蛋白的變性，根據(jù)不同表面活性劑濃度下形成的復合物的擴散系數(shù)，分析了復合物的結構變化，確定了改變蛋白質天然構象所需的表面活性劑的最低濃度。 MADADLOU 等[12]研究了乳清蛋白與低分子量表面活性劑吐溫(Tween)的絡合及形成的乳清-唾液蛋白聚集物的特性。Tween 將β-乳球蛋白二聚體分解為單體，降低了不溶性聚集體的大小。 此外，表面活性劑的絡合作用也降低了乳清蛋白的表面疏水性和蛋白質分子間的相互作用。 DAN 等[13]研究了β-Lg 與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉混合溶液在水/空氣和水/正己烷界面形成的吸附界面層的界面壓力，從而考察了蛋白質/表面活性劑體系在界面上的相互作用。

現(xiàn)有關于β-Lg 相互作用的文獻多為β-Lg 與陰離子表面活性劑及嵌段共聚物的報道[14-17]，β-Lg與陽離子表面活性劑相互作用的研究較少見。 文章通過表面張力、電導率、圓二色光譜及內源熒光光譜等手段考察了3 種咪唑類表面活性劑1-烷基-3-甲基溴化咪唑(C12mimBr、C14mimBr 及C16mimBr)與β-Lg相互作用過程中的作用方式以及β-Lg 結構的變化，補充了β-Lg 的基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

咪唑類表面活性劑1-烷基-3-甲基溴化咪唑的結構式如圖1 所示。 C12mimBr、C14mimBr 及C16mimBr為依據(jù)文獻[18]合成的產(chǎn)品，其合成過程為:在氮氣保護的條件下，控制溫度在75 ～80 ℃之間，甲基咪唑、過量的溴代烷烴以及乙腈攪拌回流反應48 h，旋轉蒸發(fā)除去過量的溴代烷烴和乙腈；減壓蒸餾以除去水，即得到最終產(chǎn)物。 產(chǎn)物經(jīng)過核磁共振圖譜確定其純度。 β-Lg 購自美國默克(Sigma-Aldrich)公司。

圖1 1-烷基-3-甲基溴化咪唑結構示意圖

1.2 實驗方法

用3 次蒸餾水分別配制了3 種咪唑類表面活性劑/β-Lg(β-Lg 為0.18 g/L)體系的溶液，未加入緩沖溶液調節(jié)pH 值。 每次實驗時，測量體系的pH 值均在7～7.2 之間。 因為β-Lg 的等電點為5.3，所以實驗時β-Lg 顯負電性。

表面張力數(shù)值是用吊環(huán)法在JYW-200B 型表面張力儀上通過單測的方法得到的，至少測量3 次，直到測得的差值＜0.2 mN/m。 實驗溫度分別為25、35、45 ℃。

使用DDS-307 型電導率儀測量體系的電導率，實驗溫度為25 ℃。

遠紫外圓二色光譜通過JASCO J-810 圓二色光譜儀進行測量。 使用1 mm 的圓形石英池，其帶寬為2 nm。 通過儀器自帶的Secondary structure 軟件計算不同表面活性劑濃度下β-Lg 中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則蜷曲的量。 實驗溫度為25 ℃。

使用Perkin Elmer LS-55 熒光光譜儀進行內源熒光的測量，固定激發(fā)波長為280 nm，在295 ～440 nm范圍掃描表面活性劑/β-Lg 體系的熒光光譜圖。 實驗溫度為25 ℃。

2 結果與討論

2.1 咪唑類表面活性劑/β-Lg 體系的表面張力及電導率

分別測定了25、35、45 ℃下C12mimBr/β-Lg 體系的表面張力值，如圖2 所示。 圖2 中曲線出現(xiàn)了3 個較明顯的拐點，對應的表面活性劑濃度分別稱為T1、T2及 臨 界 膠 束 濃 度( Critical Micelle Concentration，CMC)。 由圖2 可知，溫度的改變對T1及T2并沒有影響。 由于溫度對靜電相互作用的影響很小，可知C12mimBr 在濃度為T1及T2時，與β-Lg的相互作用以靜電作用為主[19]。 開始時，加入的C12mimBr 以極性咪唑頭基與β-Lg 帶負電的氨基酸殘基相結合，曲線出現(xiàn)第一個拐點T1。 隨著C12mimBr的逐漸加入，吸附在β-Lg 表面的表面活性劑分子增多，β-Lg 表面的吸附達到飽和。 由于β-Lg含有兩個二硫鍵，繼續(xù)加入的C12mimBr 導致β-Lg 的一對二硫鍵斷裂，暴露出了更多的極性基團，新加入的C12mimBr 分子又能夠以其極性頭基吸附在這些暴露的氨基酸殘基上，表面張力曲線出現(xiàn)第二個拐點T2。 繼續(xù)加入C12mimBr 至濃度為CMC，其在β-Lg上的吸附達到飽和后，開始形成膠束。

圖2 C12mimBr/β-Lg 在不同溫度下的表面張力圖

測定了25 ℃下3 種表面活性劑/β-Lg 體系的表面張力值，如圖3 所示。 得到的T1、T2與CMC 的數(shù)值見表1。 與未加入β-Lg 相比，表面活性劑/β-Lg 體系的CMC 有顯著增大，說明表面活性劑在β-Lg 上先于膠束形成發(fā)生了強烈的吸附，之后再在水中形成聚集體。

表1 25 ℃時3 種表面活性劑/β-Lg 體系的T1、T2及CMC 數(shù)值表

圖3 25 ℃時3 種表面活性劑/β-Lg 體系表面張力圖

測定了3 種表面活性劑/β-Lg 體系的電導率，如圖4 所示。 雙折線的折點對應著膠束的形成。 通過電導率曲線可以更清楚地得到β-Lg 存在時3 種表面活性劑的CMC。 C12mimBr/β-Lg、C14mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg 體系中表面活性劑的CMC 分別為0.35、0.035 及0.04 mol/L，與表面張力法得到的CMC 處于同一數(shù)量級。

反離子解離度α=膠束形成后的直線斜率/膠束形成前的直線斜率，反離子結合度β=1-α。 由圖4 計算得到C12mimBr/β-Lg、C14mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg體系的反離子結合度β分別為0.19、0.28及0.40。

圖4 3 種表面活性劑/β-Lg 體系電導率圖

2.2 咪唑類表面活性劑/β-Lg 體系的光譜學研究

2.2.1 遠紫外圓二色

表面活性劑與BSA 的相互作用會導致BSA 的結構發(fā)生一些變化，可以通過圓二色光譜檢測BSA二級結構的改變。 在圓二色光譜上，α-螺旋結構的特征峰表現(xiàn)為208 及222 nm 附近的兩個負槽，β-折疊結構的特征峰表現(xiàn)為215 nm 附近的負槽。 因為β-Lg 中β-折疊構象的量遠超過α-螺旋構象的量，所以圓二色圖譜的負槽出現(xiàn)在215 nm 附近。

表面活性劑/β-Lg 體系隨表面活性劑濃度變化的遠紫外圓二色光譜如圖5 所示。 在圖5(a)中，當C12mimBr 濃度逐漸增加到3×10-5mol/L 時，β-Lg的β-折疊的量顯著降低，二級結構完全被破壞。 在圖5(b)和(c)中，當C14mimBr、C16mimBr 的濃度分別增加到1×10-4mol/L 時，完全破壞了β-Lg 的二級結構。 結合表面張力結果可知，此時的表面活性劑濃度＞T1，β-Lg 的一個二硫鍵斷裂，三級結構改變的同時二級結構也遭到了破壞。 通過圓二色結果可知，咪唑類表面活性劑對β-Lg 的二級結構有較大的破壞性，很低的濃度就能造成β-Lg 結構的改變。

圖5 3 種表面活性劑/β-Lg 體系遠紫外圓二色光譜圖

2.2.2 內源熒光

表面活性劑/β-Lg 體系中β-Lg 的內源熒光隨表面活性劑濃度的變化如圖6 所示。 色氨酸殘基的熒光光譜對微環(huán)境的變化很敏感，其峰位一般在325～350 nm 之間變動。 由圖6 可以看出，β-Lg 的熒光發(fā)射峰位于350 nm 附近，是色氨酸殘基的特征熒光光譜。 β-Lg 的最大熒光發(fā)射峰峰位置并不隨著表面活性劑濃度的增加而改變，說明表面活性劑沒有造成色氨酸殘基周圍微環(huán)境的改變，沒有與色氨酸殘基發(fā)生結合。 C12mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg 體系最大熒光發(fā)射峰峰值隨著表面活性劑的加入出現(xiàn)了先增大后減小的現(xiàn)象，說明色氨酸殘基的溶解度發(fā)生了變化。 當加入的表面活性劑濃度較低時，造成色氨酸殘基溶解度變大，最大熒光發(fā)射峰峰值變大，隨著表面活性劑濃度的進一步增大，色氨酸殘基溶解度變小，最大熒光發(fā)射峰峰值變小。C14mimBr/β-Lg體系最大熒光發(fā)射峰峰值隨著表面活性劑的加入逐漸變小，說明隨著C14mimBr 的加入，色氨酸殘基溶解度逐漸變小。

圖6 3 種表面活性劑/β-Lg 體系內源熒光光譜圖

3 結論

通過上述研究，得到以下結論:

(1) 咪唑類表面活性劑1-烷基-3-甲基溴化咪唑與β-Lg 的作用方式與表面活性劑的濃度有關。當表面活性劑濃度較低時，作用方式為靜電相互作用，表面活性劑的加入導致β-Lg 中的二硫鍵斷裂，表面活性劑進一步與二硫鍵斷裂后暴露出的氨基酸殘基作用；當表面活性劑濃度較高時，作用方式為疏水相互作用，且相互作用對CMC 的影響很大。

(2) C12mimBr/β - Lg、 C14mimBr/β - Lg 及C16mimBr/β-Lg體系的反離子結合度分別為0.19、0.28 及0.40。

(3) C12mimBr、C14mimBr、C16mimBr 分別在3×10-5、1×10-4、1×10-4mol/L 造成了β-Lg 二級結構的改變，但表面活性劑不與β-Lg 上的色氨酸殘基直接作用。