液相色譜－串聯質譜法測定鳙魚中硝基呋喃代謝物含量的方法研究

文 史君 呂永恒 孟桂芳 秦臻 鄒城市檢驗檢測中心

在陰性鳙魚中加入鹽酸溶液和2-硝基苯甲醛后，以現行標準中37℃衍生16h為對照，優化衍生溫度和衍生時間，45℃衍生4h。而后乙酸乙酯液-液萃取濃縮，初始流動相復溶，經液相色譜-串聯質譜法測定，內標法定量。通過驗證，（45℃；4h）的衍生條件，在校準曲線、準確度、精密度、靈敏度的表現上和標準方法接近，說明該衍生條件不但能夠滿足鳙魚中硝基呋喃類代謝物的測定，還縮短了前處理時長，大大提高了檢測效率。

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用，曾廣泛應用于畜禽及水產養殖業。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有致癌、致畸胎的副作用，2019年12月27日，硝基呋喃被列入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單（中華人民共和國農業農村部公告 第250號）。

硝基呋喃類藥物在脊椎動物體內會迅速分解，生成相應的代謝物，而代謝物容易和動物組織中蛋白質結合并長期殘留，故常利用代謝物的檢測來反應硝基呋喃類藥物的殘留狀況。

目前，國家現行標準中，通過液相色譜串聯質譜方法來測定硝基呋喃代謝物是主流方法。本文通過優化衍生溫度與衍生時間，縮短了整個衍生過程，建立了鳙魚中硝基呋喃代謝物測定的快速前處理方法。通過3個高中低水平的加標回收試驗驗證該前處理方法的精密度與準確度。

1. 材料與方法

1.1 儀器與設備

液相色譜-質譜聯用儀（SCIEX 4500）；電子分析天平（Mettler Toledo MS204S)；pH計（Mettler Toledo FiveEasy Plus）；水浴恒溫振蕩器（常州潤華電器有限公司SHABA）；高速離心機（cence H1850）；渦旋振蕩器（IKA MS3 digital）。

1.2 材料與試劑

AOZ標準品（農業部環境保護科研檢測所，100μg/mL)；AMOZ標準品（農業部環境保護科研檢測所，100μg/mL）；AHD標準品（農業部環境保護科研檢測所，100μg/mL）；SEM標準品（農業部環境保護科研檢測所，100μg/mL）；AOZ-D標準品（農業農村部農產品質量標準研究中心，100μg/mL）；AMOZ-D標準品（農業農村部農產品質量標準研究中心，100μg/mL)；AHD-C標準品（農業農村部農產品質量標準研究中心，100μg/mL)；SEM·HCl-CN標準品（農業農村部農產品質量標準研究中心，100μg/mL)；2-硝基苯甲醛（色譜純）；二甲亞砜（色譜純）；乙酸乙酯（色譜純）；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；無水磷酸氫二鉀（優級純）；鹽酸（優級純）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

分別準確吸取AOZ、AMOZ、AHD、SEM標準品適量，用甲醇配制成1.0mg/mL的標準儲備液。準確吸取4種標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成100μg/L和10μg/L的混合標準溶液。

分別準確吸取AOZ-D、AMOZ-D、AHD-C、SEM·HCl-CN標準品適量，用甲醇配制成1.0mg/mL的標準儲備液。準確吸取4種標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成100μg/L的混合內標標準溶液。

1.3.2 測定步驟

取試樣2.00g于50mL聚丙烯離心管中，準確加入50μL混合內標標準溶液（100μg/L）、5mL鹽酸（0.5mol/L）、150μL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），渦旋混合1min。在水浴恒溫振蕩器中，將衍生時間和衍生溫度分別設置為（37℃；16h）和（45℃；4h）。取出離心管冷卻至室溫，用磷酸氫二鉀溶液（1.0mol/L）調pH至7.0-7.5，加入8mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30s，6000r/min離心5min，取上清液至10mL玻璃離心管中，40℃氮氣吹干。用初始流動相復溶后，過膜上機測定。

1.3.3 標準曲線制備

分別準確移取10μg/L和100μg/L混合標準工作液各0.05mL、0.1mL、0.2mL于6個50mL離心管中，除不加樣品外，按照1.3.2測定步驟進行處理，最終濃度為0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L。按1.3.4上機測定，每個濃度點測定2次。

1.3.4 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱C（150mm×3.0mm，粒徑5μm）；流動相洗脫條件見表1。質譜條件：ESI+，具體參數見表2。

表1 流動相梯度洗脫程序

表2 四種硝基呋喃代謝物及其內標的質譜參數

1.3.5 線性范圍的驗證

按照1.3.3步驟進行標準曲線線性范圍的驗證。對于準確定量的方法，線性回歸方程的相關系數不低于0.99。

1.3.6 靈敏度的驗證

在對應標準中，硝基呋喃類代謝物在水產品中的檢測限為0.5μg/kg，定量限為1.0μg/kg。分別在檢測限及定量限水平上進行加標，重復測定10次，驗證信噪比是否符合要求（檢測限S/N≥3；定量限S/N≥10）。

1.3.7 準確度的驗證

根據《中華人民共和國農業農村部公告第250號》規定，硝基呋喃類代謝物為禁用藥物，在動物性食品中不得檢出。因此，在檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限進行驗證，即0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg三個濃度水平上進行加標回收試驗，按照1.3.2進行前處理，1.3.4進行上機測定，每個加標水平重復測定10次。回收率應在60%-120%之間。

1.3.8 精密度的驗證

根據《中華人民共和國農業農村部公告第250號》規定，硝基呋喃類代謝物為禁用藥物，在動物性食品中不得檢出。在對應標準中，硝基呋喃類代謝物在水產品中的檢測限為0.5μg/kg，定量限為1.0μg/kg。因此，在檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限進行驗證，即0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg三個濃度水平上進行試驗，按照1.3.2進行前處理，1.3.4進行上機測定，每個水平重復測定10次，計算RSD。RSD應小于15%。

2. 結果與分析

2.1 標準曲線線性范圍

以目標物的濃度為橫坐標，對應濃度目標物峰面積與相應同位素內標峰面積比值為縱坐標，得到各目標物的標準曲線線性方程及相關系數（見表3）。

表3 AOZ、AMOZ、AHD、SEM 的線性方程及相關系數表

由表3可以看出，四種硝基呋喃代謝物的線性方程相關系數均大于0.99，相關性良好，可用于準確定量。

2.2 靈敏度

在檢測限和定量限水平上加標，重復10次。經檢測發現，檢測限水平上的加標測定，S/N＞3；定量限水平上的加標測定，S/N＞10。由此可見，本產品的檢測限和定量限均滿足實驗室要求。

2.3 準確度和精密度

在檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限進行驗證，每個水平重復測定10次，結果數據見表4。

表4 AOZ、AMOZ、AHD、SEM 的精密度及添加回收率

由表4可以看出，四種化合物的添加回收率在60%-120%，相對標準偏差＜30%，滿足要求。

3. 結果與分析

現行標準中，鳙魚中硝基呋喃代謝物測定的衍生時間為16h，造成整個前處理時長較長。本文通過驗證發現，（45℃；4h）的衍生條件，不但在校準曲線、靈敏度、準確度、精密度方面表現良好，能夠滿足鳙魚中硝基呋喃代謝物測定要求的同時，還大大縮短了前處理時長，提高了檢測效率，讓硝基呋喃代謝物的檢測在一天內完成已成為可能。