富營養河口水體藻華粒級結構的調控機制研究

張亞鋒 ，侯敏馳，陳容，王適，雷越，王旭濤 *，殷克東*

( 1.中山大學 海洋科學學院/南方海洋科學與工程廣東省實驗室（珠海），廣東 珠海 519082；2.生態環境部珠江流域南海海域生態環境監督管理局 生態環境監測與科學研究中心，廣東 廣州 510611)

1 引言

藻類通過光合作用將二氧化碳和無機營養鹽轉化成有機物，是海洋生態系統中的初級生產者，藻類被浮游動物攝食，而浮游動物會被更高營養級的游泳動物攝食，它們共同構成了海洋食物鏈[1-2]。小型浮游動物（粒級小于200 μm）攝食對藻類群落會產生影響，但小型浮游動物對不同粒級藻類攝食的偏好理論存在爭議[3-5]。有研究發現小型浮游動物對較小的藻類有更高的攝食速率[6]，也有研究發現相反現象[7-8]，還有研究發現這種粒級偏好并不明顯[9-10]。因此，小型浮游動物是優先選擇大細胞的藻類以便完成有效攝食，還是選擇生長較快的小細胞藻類以保證食物供給，仍需進一步研究[5,11-12]。

目前，雖有藻華期間藻類生長和小型浮游動物攝食的實地測量數據[12-14]，但是在藻華的不同階段同時監測藻類生長和小型浮游動物攝食的數據仍然不足。在藻華不同階段，關于小型浮游動物和藻類關系的研究主要有兩種途徑：其一，同一時期不同站位測定小型浮游動物的攝食速率和藻類的生長速率，然后根據水體中藻類的初始濃度來確定藻華的不同階段[7,12]；其二，在同一采樣站點連續幾周或幾月跟蹤監測藻華過程中浮游生物之間的關系[10,15-16]。前者的空間尺度大，浮游生物的組成受環境影響較大，后者由于在較長的時間范圍內不連續采樣，容易錯過藻華發生的不同階段。因此，這兩種方法都具有一定局限性。

河口水體中藻華暴發的范圍和持續時間受溫度、光照、營養和浮游動物的攝食等多種因素的影響[16-18]。珠江是中國徑流量第二大河流，較大的鹽度、濁度和營養鹽濃度等條件梯度使得珠江口水域的浮游生物處于復雜的生長環境[19-21]，人類活動引發的珠江口水體富營養化已經造成藻華和赤潮頻發[22-24]。目前包括營養鹽、光照、風力和其他物理作用對浮游生物的聚集效應在內的環境因素對珠江口水域藻華形成機制的研究已經相對比較充分[25-27]。然而，在珠江口水域暴發藻華的過程中，小型浮游動物攝食活動對藻類群落結構的影響相對較小[9-10]，缺乏營養鹽和小型浮游動物攝食活動對藻華粒級結構影響的同步研究。由于實地研究很難消除光照、風力混合等環境因素的作用，而河口水體鹽度受潮汐周期影響顯著，因此，為了對比珠江口不同區域水體中上行控制（營養鹽刺激）和下行控制（小型浮游動物攝食）對藻華粒級結構的調控，本研究利用珠江口枯水期3類鹽度水體進行室內培養實驗，并同時利用分級稀釋法估算藻類的生長速率和小型浮游動物的攝食速率，探究不同鹽度水體中：（1）營養鹽對藻類生物量和粒級的影響；（2）小型浮游動物攝食活動的粒級偏好；（3）對比上行控制（營養刺激）和下行控制（浮游動物攝食）對藻華粒級結構的影響。

2 材料與方法

2.1 采樣和實驗設計

藻華是指水體中浮游生物在短時間內暴發性增殖或聚集而使水體變色的現象，本文主要研究藻類在短時間內暴發性增殖這一過程。于2015年12月在珠江口水域上游水深 為 4 m 的站點（22°49′16′′N，113°34′00′′E；鹽度為 2.86）和下游水深為 15 m 的站點（22°00′34′′N，113°53′13′′E；鹽度為 31.71）采集表層0.5 m處的水樣，所有采集到的水樣現場用孔徑為200 μm的篩絹過濾除去中大型浮游動物，當天運回實驗室進行實驗。通過等比例混合低鹽度河水和高鹽度海水制成中鹽度的水樣（鹽度為17.25），把3類鹽度水樣分別分成兩部分，一部分添加營養鹽（額外添加的營養鹽終濃度約為 NO3-N 100 μmol/L、PO4-P 6 μmol/L ），另一部分不做處理，作為對照組。將6組水樣分別分裝在容量為2.8 L的聚碳酸酯瓶內（共60瓶），每瓶裝水樣2.5 L，放在恒溫25℃（采樣點當天實地最高溫度為 23℃）、光強恒定為 500 μmoL/（m2·s）的培養室內，進行24 h光照培養，每天搖勻培養瓶2～3次，采樣前再次充分搖勻，實驗進行5 d。培養開始前分別收集葉綠素和營養鹽樣品，培養期間每組樣品每天13：00消耗2個培養瓶進行葉綠素和營養鹽樣品收集并進行稀釋培養實驗。

取300～500 mL水樣，依次通過孔徑為20 μm、2.0 μm 和 0.2 μm 的濾膜，濾膜用錫紙包好放在?20℃冰箱保存，用來測定粒級在 20～200 μm（小型）、2～20 μm（微型）和 0.2～2 μm（超微型）的葉綠素。取過濾后的水樣50 mL到營養鹽瓶，然后將其迅速放到?20℃冰箱中冷凍保存。實驗用到的所有容器都提前用10%的鹽酸浸泡，超純水清洗過后烘干，并在實驗時用水樣潤洗。

連續5 d利用營養加富組水樣進行稀釋實驗，以測定小型浮游動物攝食速率和藻類生長速率[28]，本研究用第1天水體的稀釋實驗結果作為小型浮游動物攝食速率和藻類生長速率的初始值。利用通過0.2 μm的濾膜過濾的無藻類水稀釋正常水樣，稀釋梯度為0.25、0.5、0.75、1.0。將處理好的水樣分裝在250 mL的聚碳酸酯培養瓶中，添加終濃度分別為0.5 μmol/L NH4Cl、0.03 μmol/L KH2PO4、1 nmol/L FeCl3和0.1 nmol/L MnCl2的營養鹽[29]，另外3個不添加營養鹽的平行樣為對照組。所有培養瓶放在培養室內培養24 h，培養室溫度和光照強度分別為 25℃ 和 500 μmol/（m2·s）。在培養開始和結束時，分別用孔徑為20 μm、2.0 μm和0.2 μm的濾膜過濾，以收集不同粒級的葉綠素樣品。

葉綠素a用丙酮萃取法測定[30]。將葉綠素濾膜置于含有10 mL 90%的丙酮溶液中，在4°C黑暗條件下萃取14～16 h。離心后取上清液用熒光光度計（10-AU Turner Designs? fluorometer, 美國）測定吸光值，計算葉綠素a濃度。無機營養鹽（銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽和磷酸鹽）濃度用營養鹽自動分析儀（Futura, Alliance Instrument, 法國）進行測定。

2.2 數據分析和計算

根據藻類指數生長模型，本研究利用葉綠素a濃度估算藻類每天的比生長速率μChla=[ln(Pt/P0)]/t，其中t是培養時間，P0和Pt分別是培養前后葉綠素a的濃度。利用2.8 L培養瓶中葉綠素a濃度的每日變化，計算了實驗期間藻類群落每日的比生長速率。在稀釋實驗中，利用μChla在不同稀釋梯度上進行線性回歸，回歸方程的截距為藻類生長速率μ，斜率的相反數為浮游動物的攝食速率m，藻類被小型浮游動物攝食率為m/μ。本研究中利用2.8 L培養瓶計算的每日比生長速率μChla更接近實驗期間藻類群落每日的凈生長速率，利用稀釋法估算的藻類生長速率μ為藻類群落的內稟生長率[31]。

所有數據利用OriginPro 2021進行統計分析。用ANOVA方法來分析藻類生長速率（μ），小型浮游動物攝食速率（m）和藻類每日比生長速率（μChla）之間的相關性。當p＜0.05時，數據具有統計學意義。

3 結果

在不同鹽度梯度的自然水體中，葉綠素a的濃度隨著培養時間都表現出先增加后降低的趨勢，且其最大值隨鹽度升高而降低（圖1a，圖1c和圖1e）。營養加富能增加葉綠素a濃度的最大值，但增量隨著初始水體的營養水平增加而減弱（圖1b，圖1d和圖1f）。另外，葉綠素a濃度快速增殖的持續時間隨著營養鹽的加入明顯延長，特別是在高鹽度海水中。培養結束時，自然水體中的藻華已開始消亡，而加富河水中藻類進入穩定期（圖1f），加富混合和加富海水中的藻類仍然處于快速生長期（圖1d，圖1b）。培養前后藻類粒級結構均發生了變化，從超微型和微型藻類主導（占比大于85%），變成了小型藻類主導（占比大于50%）。葉綠素a濃度的變化與營養鹽（TIN, P）濃度的變化相一致（表1），自然水體中營養鹽濃度較低，藻類將水體中的營養鹽消耗完后藻華開始消亡；營養加富后，3類鹽度水體中營養鹽在培養結束時依然充足，藻類生長未進入衰亡期。

表1 培養實驗中自然和營養加富的河水、混合水和海水的總無機氮（TIN）、磷酸鹽（P）的濃度變化（平均值±標準偏差，單位：μmol/kg）Table 1 The concentrations (mean±SD, unit: μmol/kg) of total inorganic nitrogen (TIN) and phosphate (P) during the incubation in natural and nutrient added river water, mixed water and sea water

圖1 自然和營養加富的海水、混合水和河水中3種粒級葉綠素a的濃度Fig.1 Concentrations of three size fractionation chlorophyll a in natural and nutrient added sea water, mixed water and river water

不同鹽度水體中藻類群落每日的比生長速率變化如圖2所示，自然水體中藻類群落的凈生長大體上只持續了 2 d（μChla＞0）（圖2a，圖2c和圖2e）；而在營養加富的實驗組，藻類大體上保持凈生長，但生長速率逐漸降低（圖2b，圖2d和圖2f），小型藻類的凈生長速率第3天和第4天在整個群落中占比較大，但因為初始濃度較低，在培養3 d后成為藻華優勢種。總體而言，在藻類暴發性增殖過程中，大粒級藻類逐漸成為優勢種，而且營養加富能加大其優勢。

圖2 培養實驗中自然和營養加富的海水、混合水和河水中3種粒級藻類每日的比生長速率（μChl a）Fig.2 Daily algal specific growth rates (μChl a) for three size fractionation phytoplankton during the incubation in natural and nutrient added sea water, mixed water and river water

3類鹽度的加富水體中，m具有相似的變化趨勢，以第1天作為參考值，總攝食速率在第2天或第3天達到最大值后開始下降（圖3a，圖3b和圖3c）。總體而言，海水中的平均m（（0.68±0.19）d?1）大于混合水（（0.45±0.17）d?1）和河水（（0.51±0.18）d?1）。μ在 3 個實驗組的變化不同（圖3d，圖3e和圖3f）：藻類總生長速率在海水中保持增長，在混合水中先增加后減少，在河水中大體呈降低趨勢。總體而言，μ在海水中（（1.06±0.16）d?1）明顯高于混合水（（0.58±0.14）d?1），在河水中波動較大（（1.13±0.37）d?1）。不同粒級μ和m具有一致性（圖3a至圖3f）：海水中，小型藻類μ高于微型和超微型，小型浮游動物對小型藻類的攝食率在培養的前3天也較高（圖3a，圖3d）；混合水中，μ和m均在第2天達到最大值（圖3b，圖3e）；河水中，超微型浮游動物μ和它面臨攝食壓力的初始值都較高，而小型浮游動物μ和m都在第3天達到最大值（圖3c，圖3f）。

圖3 培養實驗中營養加富的海水、混合水和河水中3種粒級藻類和總體的生長速率（μ）、小型浮游動物的攝食速率（m）以及藻類被小型浮游動物的攝食率（m/μ）Fig.3 Microzooplankton grazing rates (m), algal growth rates (μ) and the consumption ratios of phytoplankton by microzooplankton (m/μ) for three size fractionation phytoplankton and total phytoplankton during the incubation in nutrient added sea water, mixed water and river water

3組加富實驗組中藻類被小型浮游動物的攝食率（m/μ）表現出兩個趨勢（圖3g至圖3i）：中、高鹽度水體中，初始m/μ較高（＞0.5），m/μ在前 3 天逐漸增加，然后降低（圖3g，圖3h）；在低鹽度河水中，初始m/μ較低（＜0.5），m/μ逐漸增加，在培養結束時達到1.0上下（圖3i）。總體而言，不同粒級的m/μ變化趨勢和整體的m/μ的變化趨勢一致，但超微型粒級的m/μ在 3個粒級中一直最高，當m/μ＞1時，意味著所有的超微型藻類都被小型浮游動物攝食消耗。

4 討論

4.1 上行控制對藻華的影響

藻類生長大量消耗水體中的營養鹽，當營養鹽消耗殆盡時，藻類的生長速率開始下降；當浮游動物的攝食速率大于藻類的生長速率時，藻華開始崩潰消亡[16,32-33]。在本研究中，自然水體中營養鹽的初始濃度從海水到河水逐漸增加（表1），藻類暴發性增殖的持續時間從海水中的2 d增加到河水中的4 d，而培養結束時加富水體中依然有充足的營養鹽，藻類仍然處于暴發性增殖，這說明藻類暴發性增殖的生物量和營養鹽水平直接相關。另外，營養鹽水平同樣影響藻類群落的粒級結構，長期的進化過程中，小粒級藻類在獲得營養方面具有競爭優勢[31,34]，這是培養開始時營養鹽濃度較低的自然水體中微型和超微型藻類是優勢種的原因；而在營養鹽充足且生長條件適宜的情況下，大粒級藻類具有更大的生長潛能[34-35]，這可能是小型藻類逐漸成為優勢粒級的原因。因此，營養鹽是驅動藻類暴發性生長的主要因素，上行刺激決定了藻類群落生物量的上限，并影響藻類的粒級結構。

4.2 下行控制對藻華的影響

研究發現，藻類生長越快，面臨的攝食壓力也越大[1,12]，本研究同樣發現小型浮游動物的攝食速率與藻類生長速率顯著正相關（圖4）。藻華暴發“空窗期”理論認為，藻華優勢種能利用某些綜合機制（比如細胞個體大）逃脫浮游動物的攝食，進而主導藻華的暴發[36]。根據“空窗期”暴發理論，加富水體中小型藻類成為藻華優勢種是因為小型藻類能逃脫小型浮游動物的攝食，或者說小型浮游動物對小型藻類攝食速率較低，然而除在海水組前3天外，小型浮游動物對不同粒級藻類的攝食速率并沒有明顯差異（圖3）。在全球小型浮游動物攝食速率的統計數據中，在藻類粒級結構不同的水體中，不同粒級的藻類面臨的被攝食速率基本處在同一水平[37-38]。因此，珠江口小型浮游動物攝食本身沒有粒級偏好性。

圖4 在營養加富的海水、混合水和河水中小型浮游動物的攝食速率（m）和藻類的生長速率（μ）關系Fig.4 Relationships between microzooplankton grazing rates(m) and algal growth rates (μ) in nutrient added sea water,mixed water and river water

4.3 藻華粒級結構的調控機制

上行控制對不同粒級藻類生長的刺激不同，下行控制沒有粒級選擇性，但不同粒級m/μ具有較大差異。3類鹽度加富水體中微型和超微型藻類的平均m/μ都大于小型藻類的，其中超微型和小型藻類m/μ存在顯著性差異（圖5A），說明雖然小型浮游動物對不同粒級藻類的攝食速率差異不大，但不同粒級藻類生產速率的差異造成了其面臨的攝食壓力（m/μ）并不相同。在寡營養水體，浮游動物攝食釋放的營養鹽是藻類生長所需營養鹽的主要來源，營養鹽濃度的波動使得某些機會主義藻種迅速生長，成為藻華的優勢種[12,35]；而在富營養水體中，由于小型藻類在營養鹽充足的條件下具有更大的生長速率，其面臨的攝食壓力更小，所以更容易打破下行控制，成為藻華暴發的優勢種，這解釋了加富水體中藻類群落如何由初始小粒級主導轉變為大粒級主導（圖5B）。之前研究同樣表明藻華演化受m/μ調控[12]，在營養豐富的藻華前期，m＜μ；在營養消耗完的藻華中后期，m≥μ。本研究中藻類μChla和m/μ具有顯著的負相關性（圖6），這說明隨著營養鹽的消耗，藻類生長速率減弱，同時造成m/μ升高，營養鹽刺激的減弱使得下行控制對藻類群落的控制作用加強。因此，河口富營養水體中藻類粒級結構受營養鹽刺激上行控制和小型浮游動物攝食下行控制共同調控，但在藻華暴發和消亡的短時間內小型浮游動物攝食變化并不明顯，影響藻華粒級結構的主要因素是營養鹽刺激的上行控制。

圖5 在營養加富的海水、混合水和河水中3種粒級的藻類被小型浮游動物攝食率（m/μ）（A）及3種粒級藻類葉綠素a濃度在培養初始和結束時各自占比（B）Fig.5 Ratios of three size fractionation phytoplankton consumed by microzooplankton (m/μ) (A) and percentages of three size fractionation Chl a concentration to total Chl a concentration in the initial and end incubation (B) in the nutrient added sea water, mixed water and river water

圖6 在營養加富的海水、混合水和河水中藻類的比生長速率（μChl a）和其被小型浮游動物攝食率（m/μ）的關系Fig.6 Relationships between algal specific growth rates (μChl a)and their ratios consumed by microzooplankton (m/μ) in the nutrient added sea water, mixed water and river water

5 結論

不同于寡營養大洋水體中藻類生物量受小型浮游動物攝食活動嚴格控制，河口富營養水體中豐富的營養鹽促使藻類暴發性生長，而短時間內小型浮游動物的攝食速率并沒有增加，進而降低了藻類群落面臨的攝食壓力，形成高生物量的藻華。在富營養條件下，大粒級藻類具有更大的生長速率，使得其面臨的攝食壓力較小，而小粒級藻類則面臨較大的攝食壓力，這共同導致了富營養河口水體形成大粒級主導的藻華。由于本研究中實驗水樣取自珠江口枯水期，與豐水期水體中營養鹽濃度、藻類種類及豐度具有較大不同；另外本研究利用葉綠素a濃度來表征生物量并計算藻類生長速率，沒有考慮不同鹽度水體中藻類葉綠素a濃度的種間差異，這些因素的影響都需進一步研究。