新疆阿克蘇地區部分豬場流行性腹瀉病毒的檢測與分析

劉 洋，孫鵬亮，張秋林，陳薈旭，龔學文，李蓮瑞

（1.塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300；4.阿克蘇興疆牧歌食品股份有限公司，新疆 阿克蘇 843000）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一種急性、高度傳染性腸道疫病，臨床特征為嘔吐、水樣腹瀉和脫水死亡[1]，各個年齡階段的豬群都會發病，尤其是5日齡內哺乳仔豬感染率最高，病死率也最高，幾乎為100%[2]。

近年來我國多地豬場冬、春季節發生豬流行性腹瀉，給養豬業帶來巨大的損失[3]。PEDV毒株對仔豬具有極高的致病性并可急性感染整個小腸和大腸絨毛上皮細胞，以空腸和回腸為主。PEDV感染可引起嚴重的急性萎縮性腸炎和病毒血癥，導致嚴重的腹瀉和嘔吐，造成廣泛性脫水，最終導致哺乳仔豬死亡[4]。20世紀70年代，PEDV首先在英國與比利時被發現[5-6]，后該病毒流行于歐洲和亞洲多個國家[7-8]。我國在1980年就有該病發生的相關報道[9]，自2010年來，PED在我國多地區暴發[10-12]，2015年又在我國西北地區暴發[1]。PEDV給養豬業造成了巨大的防控風險，也給養殖戶及養殖企業帶來了很大的經濟損失。

PEDV屬于冠狀病毒科、α冠狀病毒屬，病毒粒子呈多形性，具有囊膜，其基因組為單股正鏈RNA，全長約28 kb。主要有纖突蛋白S、囊膜糖蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N以及一種由ORF3基因編碼的輔助蛋白。M蛋白是一種跨膜蛋白，該蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用[13]；另外，冠狀病毒的M蛋白能夠介導機體產生α-干擾素（α-IFN）[14]。M基因比較保守，是研究PEDV遺傳演化的優先選擇基因，對PEDV增殖情況的研究以及PED的診斷和防治具有重要意義。

近年來新疆地區不斷出現PED暴發的案例，2011—2012年間新疆地區北疆4家豬場、南疆6家豬場共計10家豬場發病[15]，2013—2015年間石河子及周邊地區29個豬場發生腹瀉情況，其中22個豬場PED檢測陽性[16]，2018—2019年間新疆石河子、五家渠、烏魯木齊6個不同地區25個豬場發病，采集1 388份樣品，PED檢測陽性率達到了46.69%[17]。鑒于此，本研究采集阿克蘇地區某豬場的疑似PEDV感染的豬病料組織，進行M基因克隆與分析，為該地區PED的防控奠定基礎。

1 材料

1.1 樣品來源

樣品采集于新疆阿克蘇地區某豬場，采集疑似患有豬流行性腹瀉的7日齡以內仔豬的腸道內容物，并置于-70 ℃冰箱中保存、備用。2021年3月在塔里木大學動物科學與技術學院進行檢測。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒（ER201）、反轉錄試劑盒（AE311），購自TransGen Biotech公司；質粒小提試劑盒、Gold view核酸染料、DL 2 000 Marker，購自北京天根生化科技有限公司；pMD19-T Vector，購自大連寶生物工程有限公司；氨芐西林，購自大連美侖生物技術有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DC301），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

小型高速冷凍離心機（Centrifuge 541 5R）購自Eppendorf科技有限公司；臺式微量高速離心機（Sorvall Legend Micro 17）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；恒溫培養箱（GHP-9080）購自上海一恒科學儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（THZ-S2A）購自常州奧華儀器有限公司；潔凈工作臺（SW-CJ-2ED）購自上海博訊實業有限公司；PCR儀（TC-5000）購自英國TECHNE公司；水平電泳槽（Thermal cycler Block）購自Thermo Fisher公司；凝集成像系統（Gel DocTM XR+）購自Bio-RAD公司；高壓滅菌鍋（HVE-50）購自日本TOMY KOGYO公司；電子分析天平（AUY220）購自杭州匯爾儀器設備有限公司。

2 試驗方法

2.1 樣品處理與其總RNA的提取

豬腸道內容物的總RNA的提取參照TransGen Biotech公司RNA提取試劑盒說明書（ER201）的要求進行操作，提取樣品中的總RNA，其逆轉錄參照TransGen Biotech公司RNA反轉錄試劑盒說明書（AE311）進行操作，將獲得的cDNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 引物的設計

參照NCBI（GenBank登錄號：MN692793）的PEDV序列信息，設計PEDV M基因特異性片段鑒定的引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

引物序列為：上游引物5'-GGCGAATTCCGGT TCTATTCCCGTTGATG-3'，下游引物5'-GGCCTCG AGATGAAGCACTTTCTCACTAT-3'，預計擴增片段大小為663 bp。

2.3 PCR擴增目的基因

在PCR管中，加入cDNA 1 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，EasyTaq Super Mix 12.5 μL，用Nuclease-free Water補齊至25 μL；PCR擴增程序為94 ℃預變性300 s；94 ℃變性50 s，56 ℃退火60 s；72 ℃延伸60 s；35個循環；72 ℃保護延伸600 s。PCR結束后，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統中觀察目的條帶并對其拍照保存。

2.4 M基因的克隆及測序和序列分析

PCR產物進行回收與純化，連接pMD-19T載體，轉化DH5α，PCR鑒定后的陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果與GenBank中的30個PEDV分離株的基因序列進行BLAST比對，并使用軟件MEGA 6.0對其構建系統遺傳進化樹，進一步判斷其與國內外其它毒株的遺傳進化關系。試驗所用參考毒株序列見表1。

表1 參考毒株相關信息

3 結果與分析

樣品總RNA的提取參照TransGen Biotech公司RNA提取試劑盒說明書（ER201）的要求進行操作，RNA提取結果如圖1所示。將提取的總RNA參照TransGen Biotech公司RNA反轉錄試劑盒說明書（AE311）反轉錄成cDNA，將獲得的cDNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

圖1 樣品RNA基因電泳

3.1 M基因的PCR擴增、克隆和測序結果

以樣品的cDNA為模板，擴增M基因，PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果顯示：樣品中擴增出了大小約為663 bp的基因片段，與預期片段大小相符，電泳結果見圖2。PCR產物進行回收與純化，連接pMD-19T載體，轉化DH5α，陽性克隆的鑒定結果見圖3。PCR鑒定后的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

圖2 M基因的PCR擴增結果

圖3 陽性克隆的PCR鑒定結果

3.2 PEDV特征基因片段的序列分析結果（系統進化樹分析及同源性比較）

使用MEGA 6.0將該毒株的測序結果與GenBank中的30個參考毒株（15個全基因組毒株，15個M基因毒株）構建遺傳進化樹如圖4所示，從圖4中可以看出，該毒株與國內絕大部分毒株（9個M基因毒株，5個全基因組毒株），如：2012年河北M基因分離株HBMC2012（GenBank登錄號：JX163295），2012年福建M基因分離株FJ-LY12021（GenBank登錄號：KJ646600），2013年貴州M基因分離株ZY（GenBank登錄號：KF150217），2014年浙江全基因組分離株CH/JXZS-3L（GenBank登錄號：KF840547），2018年甘肅全基因組分離株CH/HNYY/2018（GenBank登錄號：MT090145）等屬于同一個群（Ⅰ群），親緣關系較近，處于同一分支；與部分國外毒株（5個全基因組毒株），如2018年匈牙利分離株S236（GenBank登錄號：MH593900），2019年德國分離株GER/L032205/2019（GenBank登錄號：LR812932），2019年法國分離株FR2019001（GenBank登錄號：MN056942）等屬于同一個群（Ⅰ群），親緣關系較近，處于同一分支。該毒株與國內外部分毒株（6個M基因毒株，5個全基因組毒株），如2007年河南M基因分離株YM-2007（GenBank登錄號：EU302820），2000年韓國M基因分離株KPEDV-9（GenBank登錄號：AF015888），經典毒株CV777（GenBank登錄號：AF353511），該豬場所用疫苗株AJ1102（GenBank登錄號：JX188454）等處于不同分支，親緣關系較遠。說明該毒株與2011年后國內外主要分離株M基因差異不大，與經典毒株CV777、疫苗株AJ1102及國內外早期分離株差異較大。

圖4 流行性腹瀉病毒M基因進化樹

根據測序結果，將該毒株的測序結果與GenBank中的30個參考毒株（15個全基因組毒株，15個M基因毒株）進行同源性分析，結果如圖5所示。該毒株與進化樹中Ⅰ群的同源性較高，同源性為98.8%～99.5%。其中與2012年北京M基因分離株GDZQ-1024（GenBank登錄號：KC294274）、2012年北京M基因分離株TJNH-1023（GenBank登錄號：KC294273）同源性最低，同源性為98.8%；與2012年福建M基因分離株FJ-LY12012（GenBank登錄號：KJ646600）、2014年浙江全基因組分離株CH/JXZS-3L（GenBank登錄號：KF940547）、2019年西班牙全基因組分離株PEDV-1931-1（GenBank登錄號：MN692784）等同源性最高，同源性為99.5%。該毒株與進化樹中Ⅱ群的同源性較低，同源性為96.7%～98.8%。其中與2011年福建M基因分離株FJ/PT/2011（GenBank登錄號：JQ678036）同源性最低，同源性為96.7%；與2004年江蘇M基因分離株JS-2004-2（GenBank登錄號：AY653205）同源性最高，同源性為98.8%；與經典毒株CV777（GenBank登錄號：AF353511）的同源性為97.6%；與疫苗株AJ1102（GenBank登錄號：JX188454）同源性為98%。以上結果均證明該毒株與2011年后國內外主要分離株M基因差異不大，與經典毒株CV777、疫苗株AJ1102及國內外早期分離株差異較大。推測該豬場發病可能是疫苗株和該場毒株不完全匹配，沒有提供較高保護力所致。

圖5 不同PED毒株的M基因的同源性分析及比較

4 討論

該案例發生在2020年10月份，產房仔豬以水樣腹瀉為主，嚴重脫水，發病日齡小，14日齡以下死亡率達到50%。經過前期的流行病學調查，得知該豬場采用4周批的生產模式，腹瀉苗的免疫對象主要為妊娠母豬和后備豬[18-19]，但在后備豬階段未進行系統性的馴化。該豬場PED的妊娠母豬階段免疫程序相對比較完善，自2018年以來就沒再發生改動，妊娠母豬的免疫分為跟胎免疫和全年普免。跟胎免疫分別是在產前30 d進行活苗+滅活苗的免疫，在產前10 d進行滅活苗的免疫，總共免疫兩次；全年普免分別是在3月份和6月份各進行1次活苗+滅活苗的免疫，總共免疫兩次（中間間隔6個月）。后備母豬階段免疫程序有所不足，分別在140日齡進行活疫苗的免疫和160日齡進行滅活苗的免疫。免疫所使用的疫苗均為TGE-PED（WH-1株+AJ1102株）二聯苗。總體來說PEDV的免疫程序是相對完善的，但該豬場所用疫苗株與該場毒株不是完全匹配，可能存在所使用疫苗不能給豬群提供有效保護力的情況。另外該豬場在10月份所進行生產的母豬群結構是經產母豬和后備母豬混合的結構，發病也多是從后備母豬所生產的仔豬開始。分析認為雖然母豬經過疫苗免疫，但由于母豬群結構復雜、后備母豬免疫次數較少不能給其所產仔豬提供有效的保護力，更容易感染發病。這些仔豬發病后會進行排毒，導致豬舍內病毒載量突然升高，經產母豬所產仔豬雖然能得到一定保護，但由于豬舍內病毒載量過高，導致經產母豬所產仔豬也被感染，再次進行排毒，周而復始，使豬舍內病毒載量不斷積累升高，進而導致整體豬群感染發病[20]。

通過對豬場疑似豬流行性腹瀉病毒的M蛋白的基因進行檢測，檢測到陽性樣本，基因經克隆后測序，發現該基因片段與2011年后國內外分離株（CH/HNYY/2018，CH/JXZS-3L，FJ-LY12012，C3-HB2017，GER/L03207，GER/L03205，S236，FR2019001，PEDV-1931-1）的同源性均較高，均為99.5%。這說明2011年后國內外PEDV的主要分離株M基因差異不大[21]，這與盧冰霞等[22]、張紅壘等[23]、王隆柏等[24]研究結果基本一致。

除了用M基因分析外，也有不少學者先后采用ORF3、N基因進行PEDV的同源進化分析，結果也不盡相同[25-27]，但由于M基因比較保守，因此仍是研究PEDV遺傳演化的優先選擇基因。由于本次分離的PEDV來自已經免疫過豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎二聯疫苗的豬場，因此，有必要繼續深入研究這些流行毒株的生物學特性和免疫特性。

豬流行性腹瀉的治療目前無特效方案，控制該疫病以預防為主。主要從生物安全、疫苗免疫、飼養管理防控3個方面入手進行防控。目前，市面上的TGE-PED二聯苗有一定預防效果，但變異病毒用疫苗預防效果差，現有的疫苗無法對新的變異毒株產生較好的保護，是本病難以得到有效防控的重要原因之一。因此該豬場還需要制定出系統性的可實施的有效方案，來加強后備豬的馴化管理，使后備母豬能給其所產的仔豬提供有效的保護，防止豬群再次發病[27]。通過本次試驗可以得出阿克蘇某豬場采集的疑似發病樣本存在豬流行性腹瀉病毒感染，為該豬場在豬流行性腹瀉病毒的檢測、免疫和防控方面提供理論依據及指導。

5 結論

本試驗發現，該豬場毒株和湖北分離株C3-HB2017親緣關系最近，在進化樹上同處于一個小分支，且同源性為99.5%，但仍存在3個堿基位點的突變；與2011年以后國內外主要分離株M基因親緣關系較近，在進化樹上雖不處于同一分支，但都屬于同一個大群（Ⅰ群），同源性為98.8%～99.5%。但與經典毒株CV777和疫苗株AJ1102（2012年湖北分離株）親緣關系相對較遠，在進化樹上既不處于同一分支，也不屬于同一個群；該毒株與經典株CV777同源性為97.6%，存在16個堿基位點的突變，與疫苗株AJ1102同源性為98%，存在13個堿基位點的突變。說明該場豬流行性腹瀉流行毒株可能為變異毒株。