3種消毒劑場景化消殺效果研究

李 博，陳俊宇，張 林，王貴平

（湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128）

現如今，集約化養殖程度越來越高，養殖場中傳染病流行的風險也在增加，規模化豬場中細菌病是最難以根治的疾病，而且發生的頻率也越來越高[1]，尤其是在豬病毒性疾病暴發的情況下，混合細菌性疾病和繼發感染更容易發生[2-5]，使規模化養豬場的生產和經濟效益受到嚴重威脅[6-7]。

生物安全工作的重要性不言而喻，然而仍有部分養殖場戶防控意識不強，雖然制定了嚴格的消毒程序，但在實際動物疫病防疫過程中并未切實做到位。消毒過后，殘留病原微生物只要達到適宜的條件，就會迅速傳播，暴發傳染病。市面上多種消毒劑是在實驗室試驗驗證它的消殺效果，而養殖場實際情況遠比實驗室復雜，消毒劑在養殖場生產場景中的消殺效果還需要進一步研究。本研究通過選用豬場中常見的3種消毒劑（進口過硫酸氫鉀復合物粉、國產過硫酸氫鉀復合物粉、燒堿溶液）在轉群后地面糞便表面（場景1）、干清糞后地面糞渣（場景2）、豬舍門口腳踩盆（場景3）、豬場下水道儲水池（場景4）、豬場門口消毒池（場景5）中，進行細菌消殺試驗并評估其殺滅效果，為養殖場生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與試驗地點

試驗于2021年5月5日至8月31日在湖南農業大學進行。

1.2 材料

（1）消毒劑：進口過硫酸氫鉀復合物粉，國內某代理商代理，推薦使用稀釋濃度1∶200；國產過硫酸氫鉀復合物粉，推薦使用稀釋濃度1∶200，湖南某生物科技公司生產；燒堿溶液，推薦使用稀釋濃度2%，某集團化學試劑有限公司生產。

（2）試驗豬糞便：豬糞便均來自湖南省株洲市某規模化豬場送檢樣品。

（3）主要試劑：胰蛋白胨大豆瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆肉湯培養基。

1.3 試驗方法

1.3.1 場景化一：轉群后地面糞便表面消毒效果評估

（1）制造糞球。用送檢的豬糞便制作寬約4 cm、長約5 cm、高約3 cm的半橢圓形干糞。

（2）潑灑消毒：分別在4 ℃、25 ℃、37 ℃條件下，將3種消毒劑按照推薦濃度用潑灑的方式將100 mL消毒劑潑灑到糞球表面每個部分上。

（3）取樣：分別在0（消毒前）、1、5、15和30 min后從糞球的底部、腰部、頂部3個表面點，用生理鹽水浸濕的無菌棉簽在小范圍內輕蘸取樣，放到1.5 mL離心管中。

（4）樣品處理：向裝有樣品的離心管中加1 mL無菌生理鹽水，充分震蕩混勻后，6 000 r/min，離心5 min，將上清液棄掉，目的是洗掉樣品中消毒劑成分。再加入1 mL無菌生理鹽水，充分震蕩混勻后稀釋到合適濃度，備用。

（5）涂布：取最后稀釋度的樣品重新振蕩，立即用移液器抽取0.1 mL樣品于胰蛋白胨大豆瓊脂培養基中，取涂布器均勻涂布30 s，至樣品均勻涂滿整個培養基表面，每個樣品做兩次重復。將涂布好的培養皿放入37 ℃恒溫培養箱中，過夜培養12 h。

（6）菌落計數：平板上形成30～300個菌落屬于有效范圍，統計有效活菌數。

CFU=菌落數的平均值/10-n/0.1。

（7）細菌殺滅率計算：細菌殺滅率=（試驗前樣品中菌落數-消殺后樣品中菌落數）/試驗前樣品中菌落數×100%。

1.3.2 場景化二：干清糞后地面糞渣消毒效果評估

（1）制造糞渣：用送檢豬糞便制作半橢圓形干糞，放置到老舊搪瓷盤上（模擬在粗糙地面上），用鏟子鏟掉大塊糞球后，會剩下細小糞球渣子。

（2）潑灑消毒：分別在4 ℃、25 ℃、37 ℃條件下，將3種消毒劑按照推薦濃度用潑灑方式潑灑100 mL到糞渣上。

（3）取樣：用生理鹽水浸濕的無菌棉簽分別在0（消毒前）、15和30 min時，對消毒后的糞渣蘸取取樣，放到1.5 mL離心管中。

（4）樣品處理、涂布、菌落計數、細菌殺滅率計算：同1.3.1。

1.3.3 場景化三：豬舍門口腳踩盆消殺效果評估

（1）制做腳踩盤：將1∶200進口過硫酸氫鉀復合物、1∶200國產過硫酸氫鉀復合物和2%燒堿溶液分別倒入搪瓷盤中，并用無菌毛巾完全浸入消毒劑，平鋪到腳踩盤中（模擬腳墊）。

（2）踩踏模擬：試驗人員先到臟亂地面上踩踏，保證鞋底上粘滿帶有細菌的泥土，然后在腳踏盤毛巾上踩踏。

（3）取樣：分別在0（踩踏前）、5、15、30 s，每個時間點用生理鹽水浸濕的無菌棉簽對鞋底前部、中部、后部3個位置取樣。

（4）樣品處理：向裝有樣品的離心管中加入1 mL無菌生理鹽水，充分混勻后，6 000 r/min，離心5 min，將上清液棄掉，目的是洗掉樣品中消毒劑成分。再加入1 mL無菌生理鹽水，充分震蕩混勻后稀釋到合適的濃度，備用。

（5）在試驗人員踩踏完，等30 min后對腳踏盤中消毒劑抽取1 mL樣品。用固體培養基培養細菌的方法來檢測消毒劑在時間足夠的情況下能否完全殺滅鞋底細菌。

（6）樣品處理、涂布、菌落計數、細菌殺滅率計算：同1.3.1。

1.3.4 場景化四：豬場下水道儲水池細菌消殺效果研究

（1）模擬養殖場下水道場景：將1∶400進口過硫酸氫鉀復合物、國產過硫酸氫鉀復合物和4%燒堿溶液各150 mL分別倒入燒杯中，露天放置。再向燒杯中加入150 mL含大量細菌的污水（細菌數在為5.6×106CFU/mL）。

（2）取樣：每天向燒杯中加入不定量細菌污水液。30 min后用移液器從燒杯中取1 mL于1.5 mL離心管中，6 000 r/min，離心5 min，除去上清液，目的是洗掉樣品中消毒劑成分，再加入1 mL生理鹽水混勻，備用。同時定期補充水分維持300 mL的消毒劑容積（模擬下雨天補充水分）。

（3）細菌培養：取0.2 mL樣品加入到含3 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養基的5 mL玻璃試管中，放入37 ℃恒溫搖床中180 r/min，過夜培養12 h。觀察液體培養基是否變渾濁。

1.3.5 場景化五：豬場門衛消毒池消殺效果研究

（1）模擬養殖場門衛消毒池場景：將1∶200進口過硫酸氫鉀復合物、國產過硫酸氫鉀復合物和2%燒堿溶液各300mL分別倒入燒杯中，露天放置。

（2）取樣、細菌培養：同1.3.4。

2 結果與分析

2.1 場景化一：轉群后地面糞便表面消毒效果評估

由表1、表2、表3可知，在消殺1、5、15、30 min后，糞球表面細菌殺滅率：進口過硫酸氫鉀復合物粉4 ℃為33.38%～85.30%，25 ℃為62.90%～97.37%，37 ℃為38.75%～90.00%；國產過硫酸氫鉀復合物粉4 ℃為67.30%～81.79%；25 ℃為55.63%～66.89%；37 ℃為54.70%～61.90%；燒堿溶液4 ℃為99.59%～99.77%，25 ℃為65.32%～99.90%，37 ℃為99.31%～99.90%。

表1 4 ℃ 3種消毒劑對糞球表面細菌消殺效果

表2 25 ℃ 3種消毒劑對糞球表面細菌消殺效果

表3 37 ℃ 3種消毒劑對糞球表面細菌消殺效果

在4 ℃、25 ℃、37 ℃條件下，燒堿消殺效果比同時間點的其他兩種消毒劑消殺效果均好，而且燒堿殺菌力持久強大，價格較低，在該場景消毒中更有優勢。3種消毒劑均能殺滅糞便中絕大部分細菌，但還有小部分細菌并不能殺滅，推測原因可能是糞便中有機物干擾或耐消毒劑的細菌存在。

2.2 場景化二：干清糞后地面糞渣消毒效果評估

由表4、表5、表6可知，在消殺15、30 min后，糞渣中細菌殺滅率：進口過硫酸氫鉀復合物粉4 ℃為95.49%～97.14%，25 ℃為99.27%～99.83%，37 ℃為99.94%～99.95%；國產過硫酸氫鉀復合物粉4 ℃為99.05%～99.86%，25 ℃為99.91%～99.95%，37 ℃為97.78%～99.91%；燒堿溶液4 ℃為99.94%～99.95%，25 ℃為99.96%～99.97%，37 ℃為99.97%～99.98%。

表4 4 ℃ 3種消毒劑對糞渣消殺效果

表5 25 ℃ 3種消毒劑對糞渣消殺效果

表6 37 ℃ 3種消毒劑對糞渣消殺效果

3種消毒劑對糞便殘渣中細菌殺滅效果均良好。燒堿殺菌力持久強大，價格較低，與其他兩種消毒劑相比較而言，燒堿在該場景消毒中更有優勢。

2.3 場景化三：豬舍門口腳踩盆消殺效果評估

（1）由表7可知，在消殺5、15、30 s后，鞋底細菌殺滅率：進口過硫酸氫鉀復合物粉為84.16%～98.78%，國產過硫酸氫鉀復合物粉為85.48%～98.04%，燒堿溶液82.52%～97.24%。在該場景消毒中，進口過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑更有優勢。（2）消毒液對鞋底上細菌消殺30 min后，仍然有活菌存在。對這些細菌進行分離培養，可以看出有大量菌落形成。取這些菌落進行搖菌培養后用相同消毒液進行再次消殺，結果發現消毒完全無效。這些結果提示在鞋底存在耐消毒劑的細菌。

表7 3種消毒劑對鞋底上細菌殺滅效果

2.4 場景化四：豬場下水道儲水池消殺效果研究

進口過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑，第5天液體培養基開始變渾濁，說明第5天有細菌存活；國產過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑第8天培養基開始變渾濁，說明第8天有細菌存活；燒堿第3天培養基開始變渾濁，說明第3天有細菌存活。

在豬場下水道儲水池消毒中，消毒液的更換時間：進口過硫酸氫鉀復合物粉，4 d；國產過硫酸氫鉀復合物粉，7 d；燒堿，2 d。國產過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑在該場景中消毒更有優勢。

2.5 場景化五：豬場門衛消毒池消殺效果研究

進口過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑，第9天培養基開始變渾濁，說明第9天有細菌存活；國產過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑，第13天培養基開始變渾濁，說明第13天有細菌存活；燒堿第5天培養基開始變渾濁，說明第5天有細菌存活。

在豬場門衛消毒池消毒中，消毒液的更換時間：進口過硫酸氫鉀復合物粉，8 d；國產過硫酸氫鉀復合物粉，12 d；燒堿，4 d。國產過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑在該場景中消毒更有優勢。

3 結論

在場景一，轉群后地面上糞便表面消毒中，3種消毒劑均能對糞球表面細菌有效殺滅，推薦使用2%燒堿溶液對糞球表面消毒。

在場景二，干清糞后地面糞渣消毒中，3種消毒劑在4 ℃、25 ℃、37 ℃的條件下，均能有效殺滅糞便殘渣中細菌，推薦使用2%燒堿溶液對糞球表面消毒。

在場景三，豬舍門口腳踩盆消毒中，3種消毒劑均能殺滅絕大部分鞋底上細菌，且消殺效果不相上下，推薦使用進口過硫酸氫鉀復合物粉消毒。

在場景四豬場下水道儲水池消毒和場景五豬場門衛消毒池消毒中，推薦使用國產過硫酸氫鉀復合物粉消毒。

4 討論

在不同場景化中，進口硫酸氫鉀復合物（1∶200）、國產過硫酸氫鉀復合物（1∶200）和2%燒堿溶液對細菌均有良好的殺菌效果。在轉群后地面上糞便表面場景中，3種消毒劑對糞便表面場景中細菌消殺效果整體要弱于在對干清糞后地面糞渣場景，原因可能是在進行對干清糞后地面糞渣潑灑消毒時，糞渣體積小，也比較散，能夠與消毒劑充分接觸。潑灑完后糞渣較長一段時間都浸泡在消毒液中，有機物的干擾作用減弱了，能夠充分消毒。而對轉群后地面上糞便表面潑灑消毒時，雖然糞便表面每個部分都被潑上了消毒劑，但是消毒液會流下去，而且糞便表面的消毒液也會揮發，再加上糞便表面有機物干擾作用，所以消毒劑對干清糞后地面糞渣的消殺效果要強于糞便表面中細菌消殺效果。在生產應用過程中，遇到轉群后地面殘留糞便時，飼養人員應先將大塊糞便及時鏟走，然后用大量含消毒劑的水沖洗地面，對地面糞渣進行充分消毒。

在豬舍門口腳踩盆消毒場景中，腳踩盤中消毒液當天就檢測到活菌，建議定期更換消毒液來避免耐消毒劑的細菌出現；同時強烈建議采用其他方法（如換鞋）代替踩踏消毒的方式。

豬場生產實際情況比實驗室復雜，在豬場下水道儲水池消毒中，建議消毒劑更換時間：進口過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑，2～3 d；國產過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑，3～5 d；燒堿溶液應每天更換1次。在豬場門衛消毒池消毒中，建議消毒劑更換時間：進口過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑，1周；國產過硫酸氫鉀復合物粉消毒劑，1～2周；燒堿溶液，3 d。

在場景一、二、三中，均有部分細菌不能被殺滅。推測其原因可能是糞便中耐消毒劑的細菌存在或有機物干擾。細菌抵抗消毒劑的作用機制主要包括形成生物膜、改變表面滲透性、外排性和導致酶失活等[8]。有研究發現，某些種類的病原微生物長期暴露低濃度消毒液后，就會產生耐藥性，一定劑量消毒劑作用下仍能存活，其傳染性和致病性增加[9]。采用多種消毒劑交替使用，或者選擇加熱、臭氧、UV（紫外線）等替代措施進行消毒。聯合使用多種處理方法協同作用來更徹底地消除有害微生物，避免消毒劑抗性的產生和傳播。當遇到有機物干擾時，消毒劑消殺效果會受到影響。由于消毒劑與有機物結合，會減少與病原微生物作用，有機物也起到保護微生物的作用，降低了消毒劑殺菌能力。在這種情況下，必須提高消毒劑的濃度，延長消毒時間方能達到消毒目的。在消毒前應對消毒場地進行徹底地打掃，清除雜物以防影響消毒劑與病原微生物的接觸，可大幅提高消毒效果。