COL1A1基因在3個豬群體內的多態性分析

吳華莉，張鶯鶯，黃 濟，涂尾龍，王洪洋，曹建國，談永松

（1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 閔行 201106；2.上海種豬工程技術研究中心，上海 浦東新區 201302）

COL1A1基因（Ⅰ型膠原α1亞基基因）是人類骨質疏松病的重要候選基因[1]。它編碼Ⅰ型膠原蛋白的α1鏈，Ⅰ型膠原蛋白在骨骼和結締組織中含量豐富[2]。人COL1A1基因定位于17q21.33，由51個外顯子構成[3]。人COL1A1基因多態性被證實與絕經后婦女患骨質疏松風險有關[4]。據報道，COL1A1基因突變與成骨不全癥、骨關節炎和軟組織損傷有關[5-7]。COL1A1基因的突變可能會影響膠原蛋白的生物合成途徑，影響細胞外基質-受體的相互作用，因此，COL1A1可能在成骨不全癥的發病機制中發揮重要作用[3]。COL1A1基因多態性對骨原性肉瘤患者的生存率有預后價值[8]。豬COL1A1基因序列存在突變位點，其產生的AA基因型的屠宰率與AG基因型的屠宰率差異顯著（P＜0.05）[9]。本研究通過檢測豬COL1A1基因突變位點在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內的基因型和等位基因頻率，以及在3個豬群體內群體遺傳學指標，期望為尋找豬生長發育和疾病方面的分子遺傳標記提供基礎數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗于2021年12月至2022年2月在上海市農業科學院畜牧獸醫研究所進行。采集樣品包括92頭杜洛克豬、77頭長白豬和152頭大白豬的耳組織塊，總計321頭，來源于上海祥欣畜禽有限公司。PCR試驗所用試劑和內切酶AluⅠ購于寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取采用AXYGEN基因組試劑盒提取豬耳組織DNA，測定DNA濃度，統一稀釋樣品濃度為50.0 ng/mL，-20 ℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增引物及反應條件。上游引物：5'-GCAACCTGGACGCCATCAAA-3'；下游引物：5'- TCTGGGAAGCCTCAGTGGACAT-3'[9]。PCR反應體系按照如下步驟配置： 2×Taq PCR Master Mix 27.5 μL，DNA 模板 1.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase-Free ddH2O 20.5 μL，總體積為50 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 20 min。PCR產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測試驗結果。

1.2.3 基因型分析豬COL1A1基因PCR擴增片段長度為529 bp，存在AluⅠ酶切位點。采用具有單一目的條帶PCR產物，進行限制性內切酶試驗，采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。限制性內切酶消化試驗的反應體系：PCR產物5 μL，10×Buffer 2 μL，AluⅠ0.5 μL， ddH2O 8.5 μL，總體積為16 μL。反應時間為1 h。豬COL1A1基因PCR擴增產物經過內切酶消化后產生的不同基因型判定標準見表1。

表1 豬COL1A1基因酶切后的3種基因型

1.3 數據統計及分析

計算COL1A1基因在3個豬群體內的基因型頻率、等位基因頻率以及合并基因型頻率，計算方法參見參考文獻[10]。采用GENEPOP 3.1軟件計算基因雜合度（Heterozygosity, He）、純合度（Homozygosity, Ho）、有效等位基因數（effective number of alleles, Ne）和多態信息含量（polymorphism information content, PIC）。

2 結果與分析

2.1 PCR-RFLP檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。如圖1所示AA型為1條帶，GG型為2條帶，AG型雜合子為3條帶。根據電泳檢測結果統計所有樣品的基因型。

圖1 豬COL1A1基因酶切結果檢測電泳

2.2 豬COL1A1基因在3個豬群體內的基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳學指標

采用PCR-RFLP技術，COL1A1基因在3個豬群體內的多態性檢測結果見表2。COL1A1基因的基因型頻率和等位基因頻率表現為：在杜洛克豬群體內檢測出AA型為主要基因型，雜合子AG基因型略少，只有少量GG基因型，A等位基因為優勢等位基因；在長白豬和大白豬群體內檢測AG基因型為優勢基因型，GG基因型略少，AA基因型較少，G等位基因為優勢等位基因。群體遺傳學指標分析結果顯示，COL1A1基因在杜洛克豬、大白豬和長白豬群體內PIC值在0.25～0.5之間，表現為中度多態。

表2 COL1A1基因在3個豬群體內的基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳學指標

3 討論

膠原蛋白是骨基質中最豐富的蛋白質，約占骨組織總蛋白質的80%。骨基質中膠原性質及其相對數量的改變會影響骨組織的力學特性，增加脆性骨折的易感性。膠原蛋白由α1和α2兩條肽鏈組成，它們以2∶1的比例存在于膠原纖維中，分別由COL1A1和COL1A2（Collagen type Ⅰalpha 2）基因編碼[6]。有研究證實在COL1A1 基因中已經發現多個突變與人類疾病相關，其中大多數與骨質疏松癥相關[11]。COL1A1不僅是預測嚴重骨相關疾病的主要候選基因，而且在一般人群中也是天然骨變異的主要候選基因[12]。本試驗的研究結果顯示COL1A1基因在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內呈現3種基因型。在杜洛克豬群體內AA基因型為優勢基因型，在長白豬和大白豬群體內AG基因型為優勢基因型，COL1A1基因在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內PIC值在0.25～0.5之間，表現為中度多態。A等位基因頻率在杜洛克豬群體內為優勢等位基因，G等位基因在長白豬和大白豬群體內為優勢等位基因。這與楊金娥的研究結果一致[9]。豬在養殖過程也患有骨骼疾病，如佝僂病、軟骨病和骨質疏松及后肢癱瘓等[13]。盡管加強飼料營養可以改善癥狀，但關于豬骨骼疾病與基因突變位點是否存在相關性仍需要研究。接下來可以深度挖掘豬COL1A1基因更多的突變位點，結合豬機體的生長發育指標和疾病情況，尤其是豬的骨骼代謝指標，進一步分析這些突變位點與性狀之間的相關性，從而尋求與豬骨骼疾病相關的候選基因。