兩株重組大腸桿菌高密度發(fā)酵裂解液澄清工藝研究

任培森，呂文靜，鄭新勇，劉海霞，王艷曉，朱秀同

（天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300381）

豬 鏈 球 菌（Streptococcus suis，SS）[1]和 副 豬 嗜 血 桿 菌（Haemophilus parasuis，HPS）[2]是當(dāng)前豬場最易見的細(xì)菌性疾病病原，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失。SS則可以分為1-34和1/2 共35 種血清型[3]，而HPS 可以分為1-15 個(gè)血清型[4]，二者經(jīng)常混發(fā)，主要造成豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、細(xì)菌性敗血癥及支氣管炎等[5，6]。

豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌由于血清型眾多，不同血清型之間的交叉保護(hù)性弱，使用抗生素進(jìn)行治療會產(chǎn)生耐藥性明顯上升[7，8]，影響治療效果。疫苗成為預(yù)防SS 和HPS 有效手段之一，疫苗種類有滅活疫苗、弱毒疫苗、活疫苗、亞單位疫苗及基因工程疫苗，但市面上主要是滅活疫苗和弱毒疫苗，其免疫保護(hù)力好，但是交叉保護(hù)力不明顯。而亞單位疫苗是預(yù)防豬鏈球菌新型疫苗[9]，是一種交叉保護(hù)力強(qiáng)、價(jià)格低廉的急需開發(fā)的新型疫苗。豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌亞單位疫苗的研發(fā)，為解決困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌的防控難題提供完美解決方案。

豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌亞單位疫苗采用重組大腸桿菌高密度發(fā)酵，菌體裂解液的澄清對目標(biāo)蛋白的收率影響巨大，但鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。如何實(shí)現(xiàn)發(fā)酵與純化中間過程的澄清步驟，是一項(xiàng)重要工作[10]。本文以重組大腸桿菌BL21-HP1036、BL21-palA 高密度發(fā)酵為對象，研究如何高效降低澄清液濁度，提高蛋白得率，為豬鏈球菌亞單位疫苗發(fā)酵工藝實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化破碎澄清工藝提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

豬鏈球菌與副豬嗜血桿菌菌株BL21-HP1036、BL21-palA由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

酵母浸出物和蛋白胨購自英國OXOID公司；氯化鈉購自國藥集團(tuán)；瓊脂粉購自美國BD 公司；卡那霉素、IPTG 購自北京博奧拓達(dá)公司；甲醛購自北京益利公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 主要試驗(yàn)用設(shè)備

高密度發(fā)酵罐購自上海百倫生物科技有限公司；高速離心機(jī)購湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；電泳儀購自北京六一儀器；紫外凝膠成像系統(tǒng)購自上海嘉鵬科技有限公司；超聲波破碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；小型高速離心機(jī)購自賽默飛世爾科技公司；紫外分光光度計(jì)購自美國BIRAD 公司；恒溫?fù)u床購自上海蘇坤有限公司；親和層析設(shè)備購自榮捷生物工程（蘇州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高密度發(fā)酵培養(yǎng)菌

將鑒定合格的重組大腸菌BL21-HP1036 株和BL21-palA 株二級種子菌液按2%（V/V）分別接種于合成培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)35～40 h。

1.2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

發(fā)酵液OD600=40±0.1 時(shí)，開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為35℃±0.5℃，誘導(dǎo)10 h結(jié)束培養(yǎng)。

1.2.3 高壓均質(zhì)破碎與離心

滅活檢驗(yàn)合格的菌液采用高壓均質(zhì)機(jī)破碎分別進(jìn)行菌體裂解，壓力100～150 MPa，破碎完成后將破碎液低溫保存。

上清液獲得：用高速離心機(jī)離心，離心轉(zhuǎn)速：15 000 rpm，溫度控制：10℃～15℃，進(jìn)樣速度：0.5～1 L/min 分別收集上清，上清液用去除內(nèi)毒素的容器進(jìn)行裝盛。

1.2.4 微濾膜包澄清

將膜包用10 L 的純化水單向沖洗，進(jìn)行切向流過濾。取管線離心機(jī)離心后的破碎菌懸液300 mL，利用0.45 μm 微濾膜包進(jìn)行澄清，分別取樣測濁度，對比離心后濁度、微濾膜包澄清液濁度、微濾膜包濃縮液上清濁度，并對樣品層析及電泳檢測蛋白含量，評估蛋白得率，利用兩步法來進(jìn)行澄清。

2 結(jié)果

2.1 BL21-HP1036和BL21-palA蛋白澄清數(shù)據(jù)與試驗(yàn)結(jié)果

圖1 結(jié)果表明，經(jīng)過管式離心方法，BL21-HP1036 和BL21-palA 重組大腸桿菌破碎液濁度分別由4 500 NTU 和4 000 NTU 降低至1970 NTU 和520 NTU；而經(jīng)過微濾膜包方法，BL21-HP1036 和BL21-palA 重組大腸桿菌破碎液濁度降低至25 NTU 和1.28 NTU。由此可見，采用微濾膜包切向流過濾，優(yōu)化開放式流道，比傳統(tǒng)的離心機(jī)過濾澄清效果在降低內(nèi)毒素、降低層析料液粘稠度及濁度有著良好的效果，可顯著降低破碎重組大腸桿菌的雜蛋白及核酸。

圖1 BL21-HP1036和BL21-palA重組大腸桿菌澄清工藝濁度Fig.1 The turbidity of BL21-HP1036 and BL21 palA recombinant escherichia coli clarification process

2.2 BL21-HP1036和BL21-palA樣品蛋白回收率

由表1、圖3 來看重組大腸桿菌BL21-HP1036 蛋白在微濾滲出澄清液和微濾膜包濃縮液上清均存在，將微濾滲出澄清液和濃縮液上清中的蛋白回收后蛋白總收率約為88.5%；BL21-palA蛋白同樣存在于微濾滲出澄清液和微濾膜包濃縮液上清，蛋白總收率是81.5%。

表1 BL21-HP1036和BL21-palA二步法澄清蛋白回收率Tab.1 The BL21-HP1036 and BL21 palA two-step clarified protein recovery

圖2 BL21-HP1036、BL21-palA SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2 The BL21-HP1036 and BL21 palA SDS polyacrylamide gel electrophoresis

3 結(jié)論

本文中分別表達(dá)豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌關(guān)鍵基因BL21-HP1036 與BL21-palA 的菌株經(jīng)過高密度發(fā)酵，通過0.45 μm 微濾膜包澄清工藝，顯著降低料液的濁度，表明采用微濾膜包切向流過濾技術(shù)澄清破碎大腸桿菌，比高速離心機(jī)離心澄清效果較好，可顯著降低破碎重組大腸桿菌的雜蛋白及核酸。 單獨(dú)微濾膜包收集清夜后，有62.9% 的BL21-HP1036目標(biāo)蛋白在微濾滲出澄清液中，37.1% 為微濾濃縮液或者存在于微濾膜包內(nèi)及其他損失，故采用兩步法澄清，第一步用0.45μm 微濾膜包進(jìn)行澄清收集滲出液，第二步將剩余在濃縮液進(jìn)行管式離心后收集上清，兩步澄清液合并作為層析樣品，其濁度值不會明顯上升，蛋白得率可達(dá)85.5% 以上，BL21-palA 發(fā)酵液，經(jīng)過二步法處理蛋白收率可達(dá)到81.5%。

本研究表明二步法澄清工藝可以有效解決澄清難題，有效降低層析干擾，降低層析填料負(fù)荷、提高目標(biāo)蛋白回收率、提升工作效率，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。