山西平陸野葛根愈傷組織誘導與培養條件篩選

張 靜，王剛獅，劉瑞霞，時寶凌，廉梅霞

（山西林業職業技術學院，山西 太原 030009）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料選用新鮮采挖的山西運城平陸縣野生葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi作為外植體。試劑為植物激素：2,4-D，6-BA，KT；蔗糖，瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 MS、B5基本培養基誘導野葛根愈傷組織情況

選擇直徑約1 cm、外表皮無破損的根，切成10 cm 的長段，進行外植體消毒。先放入75% 的酒精溶液中30 s，用鑷子取出后，再倒入0.2% 的HgCl2水溶液中浸泡8 min，取出后用無菌水沖洗5～6 次。在超凈工作臺將滅菌后的根段切成0.5 cm 長的小段，接種于B5培養基和MS培養基中，激素種類和濃度一致，均為2 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L KT。2 種培養基分別接種20 瓶，每瓶4 段外植體，置于培養箱中，條件為25℃、黑暗培養。每隔3 d 觀察培養情況，記錄生長狀況，30 d 后統計誘導率。

1.2.2 不同外源植物激素的添加對野葛愈傷組織誘導情況

在MS 基本培養基中添加外源激素，分別為2,4-D、6-BA、KT、NAA，激素的配比和濃度見正交試驗表1。試驗重復3次。

表1 外源植物激素對野葛愈傷組織誘導影響正交試驗Tab.1 The orthogonal effects of exogenous phytohormones on induction of wild callus

1.2.3 愈傷組織生長曲線繪制及不同時期總黃酮含量測定

稱取上一步培養的愈傷組織1.0±0.1 g，要求質地松軟，長勢良好。接種于繼代培養基中，培養基配方為：MS+蔗糖3%+0.6% 瓊脂+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT。培養條件不變，黑暗、25℃。共接種90 瓶。培養周期為30 d，每隔2 d 取出6 瓶，用天平稱量愈傷組織的鮮質量并記錄。之后低溫烘干，取0.2 g 粉末，放入具塞錐形瓶中，加入20 mL 70% 的酒精，超聲波處理30 min，溫度為70℃，冷卻、過濾，等濃度的酒精定容至20 mL容量瓶中，用分光光度法測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.2.4 光照條件對愈傷組織生長及總黃酮合成的影響

將接種的愈傷組織90 瓶，平均分成3 組。每組采用不同的光照周期：分別為24 h光照、16 h光照+8 h黑暗、24 h黑暗。培養30 d 后，稱量愈傷組織鮮質量，記錄。低溫烘干，提取、分光光度法測定不同光照時間對總黃酮含量的影響。

2 結果

2.1 基本培養基對野葛根愈傷組織誘導的影響

根據外植體出愈時間、愈傷組織誘導率、愈傷組織細胞狀態來評價愈傷組織誘效果。由表2可知：MS基本培養基誘導愈傷組織的效果最好，誘導率為95%。接種外植體后的第10 d，在根的橫斷面、去掉表皮的根表面，均長出淡黃色、質地松軟的愈傷組織圖1（1）。在培養25 d時，愈傷組織數量明顯增多，細胞疏松，分散性好，顏色鮮艷，質地軟嫩。相比較B5培養基中的愈傷組織，出現時間較晚，在18 d 才初露少量的細胞，后期生長速度緩慢，分散性差，顏色為黃褐色。

表2 基本培養基對野葛根愈傷組織誘導的影響Tab.2 The effects of basic media on induction of callus

2.2 不同植物激素對野葛根愈傷組織誘導的影響

使用SPSS19.0進行數據極差分析，見表3。

由表3極差R可知，2,4-D是影響野葛根愈傷組織誘導的最主要影響因素。最優激素組合為：A3B2C2D2。即：2.0 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L KT+ 1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA。

表3 不同激素對野葛愈傷組織誘導的影響Tab.3 The effects of different hormones on induction of callus

2.3 愈傷組織生長曲線與不同時期總黃酮含量測定

在接種10 d 后，外植體的斷面開始形成黃白色的愈傷組織，在生長17 d時體積增大一倍，鮮質量為2.74 g，見圖1（2），在生長26 d 時，愈傷組織幾乎擴張至整瓶，鮮質量高達為7.51 g，見圖1（3）；在培養28 d后，愈傷組織細胞停止生長，甚至有些開始死亡，顏色由淡黃色轉變為黃褐色，鮮質量在30 d時下降為6.67 g，見圖1（4）。生長曲線見圖2。

由圖2 可知：0～10 d 為愈傷組織生長的延滯期，10～22 d為愈傷組織指數生長期，22～26 d 為穩定期，26～30 d 為衰亡期。總黃酮的含量與細胞生長量呈正相關。延滯期總黃酮含量最低，為1.35%；在指數生長期，總黃酮含量迅速增高，在26 d時含量高達15.17%；到衰亡期總黃酮含量開始下降。

圖2 野葛根愈傷組織生長曲線與總黃酮含量變化Fig.2 The growth curve and callus total flavonoids content

2.4 光照時間對愈傷組織生長及總黃酮合成的影響

由圖3可知：在光照24 h條件下，愈傷組織顏色為黃褐色圖1（5），鮮質量為7.56 g，總黃酮含量為16.75%。24 h黑暗條件下，愈傷組織為黃白色圖1（6），鮮質量6.3 g，總黃酮含量為14.83%。在16 h 光照+8 h 黑暗條件培養下，愈傷組織為淡黃色圖1（7），鮮質量為7.60 g，總黃酮含量為15.30%。因此，最適合愈傷組織培養的條件為16 h光照+8 h黑暗。

圖1 愈傷組織變化Fig.1 The changes of callus

圖3 光照時間對野葛細胞生長及總黃酮合成的影響Fig.3 The effects of light time on wild Ge cell growth and total flavonoid synthesis

3 討論

3.1 最適合野葛根愈傷組織誘導的培養基為MS 基本培養基

基本培養基的作用是為植物細胞提供基本的營養，常用的基本培養基有4 中MS、B5、N6 和White。其中MS 培養基在組織培養中被廣泛使用，因為其具有較高濃度的無機鹽。而B5培養基中銨鹽含量低，適用于雙子葉植物的組織培養以及懸浮細胞培養[1]；N6 培養基中營養成分簡單，氮源含量低，適用于谷類植物的花藥培養；White 培養基中無機鹽濃度低，一般用于生根培養[2]。

本試驗選取MS 和B5 基本培養基進行篩選。結果表明：在愈傷組織誘導階段，MS 培養基產生的愈傷組織誘導率高，細胞分散性好，是理想的愈傷組織誘導培養基。

3.2 多種激素協同作用可以提高愈傷組織的誘導率

一般情況下，在培養基中外植體脫分化形成愈傷組織，與所添加的外源植物激素的種類、濃度和配比有很大的關系。外源激素起著傳遞信號的作用，其作用效果與外植體中內源激素的種類和濃度密切相關，外源激素通過內源激素發揮作用[3]。因此，只有合理地使用各種外源激素，才能適應外植體對激素的特定要求，充分發揮激素的調節作用，從而誘導愈傷組織的產生[4]。

2,4-D對于愈傷組織的誘導和生長非常有效[5]，一般情況下，誘導產生愈傷組織的2,4-D 的濃度多為0.1～2.0 mg/L。在本試驗中，單純使用2,4-D 時，愈傷組織可以快速形成，但細胞呈黏液化，因此，需要與其他的細胞分裂素一起使用，保證細胞呈現很好的顆粒狀與分散性。NAA 雖然不是愈傷組織誘導中重要的植物激素，但很多研究表明，NAA 對愈傷組織的誘導也有很重要的影響。林婭等[6]和龍雯虹[7]分別發現在月季和蘿卜愈傷組織的誘導中NAA的效果優于2,4-D；田文忠[8]在含2.0 mg/L 2,4-D 的培養基中添加1.0 mg/L KT 和1.0 mg/L NAA后，愈傷組織不再粘液化，并且顆粒增多。因此，本試驗選擇將NAA 作為誘導愈傷組織的激素，與2,4-D、KT 一起使用，得到了分散性好的疏松、顆粒狀的愈傷組織。

3.3 在愈傷組織指數生長末期總黃酮含量最高

愈傷組織的生長過程是細胞分裂的過程，而細胞的分裂需要培養基為其提供養分，隨著細胞量的增多，培養基中的養分會逐漸消耗，錐形瓶的空間也會逐漸減小，而細胞的代謝產物隨著細胞生長的積累也會逐漸增多，過多的次級代謝產物又會對細胞造成傷害，因此，為了確定最適的繼代培養周期，本試驗對細胞的生長曲線進行了測定。

植物細胞的生長進程大致相同，生長曲線呈“S”型。包括4 個時期：①延遲期。指剛接入培養基的細胞還未適應新的環境，細胞生長緩慢的時期。②指數生長期。指經過延遲期的適應，加之培養基中營養充足，細胞迅速生長的時期。③穩定期。指隨著營養物質逐漸被消耗，細胞生長速度減緩，細胞的死亡率等于生長率的時期。④衰亡期。指培養基中營養物質消耗殆盡，細胞死亡率大于生長率的時期[9]。在本研究中通過愈傷組織生長曲線，可以看出野葛愈傷組織的停滯期較長，為10 d；整個生長周期為28 d左右，總黃酮在26 d左右達到最大。這一結果與陳剛等[10]的研究結果相一致。在藥用植物細胞培養中，細胞一般會在指數生長期后期，由初生代謝進入次生代謝[11]，因而在穩定期末期可以獲得最高的次級代謝產物量。

3.4 光周期培養有利于野葛愈傷組織生長與總黃酮的合成

光不僅是植物進行光合作用的能量來源，也作為重要的環境信號調節植物的基因表達、影響酶活性以及植物的形態建成等[2]。光照對藥用植物細胞培養的影響主要體現在光質、光強和光照時間上[12]。許多研究均表明，光照有利于植物細胞中黃酮物質的合成。如陳學森[13]將銀杏愈傷組織在不同光照條件下培養后，發現光照培養所得黃酮是暗培養的3 倍。許多研究[14]也證明光照可以加強黃酮生物合成過程中的關鍵酶（PAL）的活性。但是，光照時間過長會引起脅迫，導致產生酚類化合物，導致褐化的發生。因此，獲得高生物量和獲得高次級代謝產物的條件往往是矛盾的，尋找恰當的光周期是獲得高產與高效成分的關鍵。本研究的光周期為16 h光照+8 h黑暗此時，生物量與總黃酮含量均較高。