保加利亞乳桿菌噬菌體CC34 裂解基因的克隆表達及功能鑒定

盧 野，董右銘

（四平市產品質量檢驗院，吉林 四平 136000）

噬菌體（bacteriophage） 是感染細菌的一種病毒，噬菌體分布極廣，凡是有細菌的場所，就可能有相應噬菌體的存在[1]。由于其可以在宿主體內快速復制及繁殖的特性，目前被廣泛用于抑制多種食源性致病菌的感染[2-3]。但在酸奶發酵過程中所需要的乳酸菌也逃脫不了噬菌體的感染，造成乳酸菌產酸量降低產生的品質問題，從而導致生產方的經濟損失[4-6]。酸奶目前銷售量不斷上升，人們對酸奶飲品的青睞也日益提高，但噬菌體的感染使酸奶在發酵過程中風味變差，品質下降甚至產酸終止等現象一直困擾著酸奶業。目前，關于乳酸菌噬菌體的分離，酸奶發酵中噬菌體污染的預防已有很多報道，但對乳酸菌噬菌體的功能基因開發、鑒定卻研究很少[7-8]。試驗對酸奶中分離到的保加利亞乳桿菌噬菌體CC34 的裂解基因進行克隆、表達及功能的初步鑒定，為酸奶工業噬菌體污染的預防奠定基礎[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株與質粒

大腸桿菌 DH5α（TaKaRa）、pET-28b（+）（Novagen）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、噬菌體CC34，實驗室提供。

1.1.2 試劑

凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、基因組DNA 提取試劑盒、各種限制性內切酶、T4 連接酶、Taq 酶，大連寶生物公司 （TaKaRa） 提供；DNA 純化試劑盒，長春庫美生物科技有限公司提供；Gold erView染料（SBS）、中范圍蛋白質標準分子量（MBI），長春翊博生物科技有限公司提供；TAE 電泳緩沖液，Tris 緩沖液 （pH 值 7.2）、PBS 緩沖液 （pH 值 7.2）、Tris - 甘氨酸電極緩沖液，由實驗室事先配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 裂解基因e 的PCR 擴增

根據噬菌體CC34 片段測序結果，對e 基因開放閱讀框設計一對特異性引物（ATAGCCATGGCAGGCATTCGTTG，下劃線為Nco Ⅰ酶切位點） 及（ATG-GGTCGACGGTAAGCCTGGAA，下劃線為SalⅠ酶切位點），由大連TaKaRa 公司合成。以噬菌體基因組DNA 為模板，擴增條件為94 ℃，3 min；94 ℃，45 s；57 ℃，45 s；72 ℃，90 s；總共循環 30 次；72 ℃延伸10 min。擴增結束后取2 μL PCR 產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，在紫外照射下回收目的片段，根據TaKaRa 凝膠回收試劑盒說明書對e 基因的PCR 擴增產物回收純化，將產物放置在-20 ℃下保存。

1.2.2 表達載體pET- 28b（+）- e 的構建及鑒定

擴大培養含有pET-28b（+）質粒的大腸桿菌，按照TaKaRa 質粒小提試劑盒提取pET-28b（+）質粒，與1.2.1 得到的膠回收產物分別用NcoⅠ和SalⅠ2種限制性內切酶進行雙酶切，酶切產物經電泳檢測后純化回收2種產物，以質粒∶DNA = 1∶10 的比例用T4 連接酶連接過夜，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞，過夜培養后挑取疑似陽性菌落通過雙酶切進行鑒定是否轉化成功。

1.2.3 pET- 28b（+）- e 的 IPTG 誘導表達

將轉化成功的pET-28b（+）-e 的大腸桿菌BL21接種至5 mL LB 液體培養基（含25 μg/mL 卡那霉素）中，于37 ℃下以轉速200 r/min 振蕩培養過夜；以1%的接種量接種至50 mL LB 液體培養基（含25 μg/mL卡那霉素） 中，培養溫度及轉速與上述步驟相同，OD600達 0.4～0.6； 加 入 500 μL IPTG 至 終 濃 度 為1 mmol/L 誘導，繼續以相同的培養溫度及轉速培養，每間隔1 h 取誘導后的菌液1 mL；將菌液離心后分別收集上清液和沉淀物，沉淀物用50 μL PBS 重懸沉淀，于-20 ℃下保存待用。

1.2.4 pET- 28b（+）- e 表達產物 SDS- PAGE分析

細菌沉淀加入2×SDS 樣品緩沖液50 μL，充分混勻后，放置沸水中煮5 min，配制12.5%的SDSPAGE分離膠，5%濃縮膠，取10 μL 樣品電泳，電泳結束后用銀染法顯色。

1.2.5 pET- 28b（+）- e 細菌的溶菌試驗

將1.2.3 步驟中誘導表達的細菌沉淀分別用TBS和PBS 重懸，冰浴超聲 10 s，間隔 10 s，30～50 循環，直至樣品變清亮；超聲完成后，于4 ℃下以轉速12 000 r/min 離心20 min，轉移上清進行溶菌試驗。取100 μL 生長到對數期的指示菌（保加利亞乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）分別與3 mL LB半固體培養基混勻，均勻鋪在有下層LB 固體培養基上。將無菌的牛津杯放在鋪有指示菌的上層瓊脂上，依次加入 100 μL 的 pET-28b（+）-e，pET-28b（+）（空白對照） 的超聲上清，于30 ℃下培養過夜，第2 天觀察溶菌圈。

2 結果與分析

2.1 裂解基因e 的PCR 擴增結果

以噬菌體基因組為模板，可以擴增得到一條大小在490 bp 左右的特異性條帶，與目的片段e 基因的大小相符。

裂解基因e 的PCR 擴增結果見圖1。

圖1 裂解基因e 的PCR 擴增結果

2.2 表達載體pET-28b（+）-e 的雙酶切鑒定結果

用 Nco Ⅰ和 Sal Ⅰ對構建好的 pET-28b（+）-e 載體進行雙酶切，得到5.3 kD 和490 bp 2 條片段（圖2），分別對應pET-28b（+）和e 基因的大小，與預期結果一致。

雙酶切鑒定結果見圖2。

圖2 雙酶切鑒定結果

2.3 pET-28b（+）-e 表達產物 SDS-PAGE分析

pET-28b（+）-e 的細菌沉淀總蛋白及表達上清總蛋白在18 kD 附近都有一明顯的蛋白表達帶（黑箭頭所指），分子量大小與預期相符。pET-28b（+）-e在誘導表達后的第2，第3 小時的表達量最大，之后減少。與之相反的是pET-28-e 的表達上清的目的蛋白在誘導表達的后期（4，5，6 h） 卻增加（圖4）。出現這種情況的原因是pET-28-e 在誘導表達時會出現溶菌，表達宿主的大量死亡，使本來胞內表達的e蛋白釋放到培養液里。

pET-28b（+）-e 細菌沉淀總蛋白的 SDS-PAGE見圖3，pET-28b（+）-e 表達上清總蛋白的SDS-PAGE見圖4。

圖3 pET-28b（+）-e 細菌沉淀總蛋白的SDS-PAGE

圖4 pET-28b（+）-e 表達上清總蛋白的SDS-PAGE

2.4 pET-28b（+）-e 蛋白粗提液的溶菌試驗結果

pET-28-e 細菌沉淀超聲所得到的粗提液對保加利亞乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌都有不同程度的溶菌作用，而且其在Tris 緩沖液的活性比PBS 緩沖液的活性強。

pET-28b（+）-e 蛋白粗提液對不同細菌的溶菌試驗結果見表1。

表1 pET-28b（+）-e 蛋白粗提液對不同細菌的溶菌試驗結果

3 結論

成功構建了酸奶中乳酸菌噬菌體CC34 的裂解基因 e 的表達載體：pET-28b（+）-e。pET-28b（+）-e的胞內表達，使e 的表達量有極大的提高，根據溶菌試驗的證明，pET-28b（+）-e 表達的e 對多種細菌都有溶菌作用，e 的表達量大，但溶菌活性表現還不是很強，可能是pET-28b（+）-e 表達有相當一部分形成沒有活性的包涵體，只有少部分以可溶性蛋白表達的原因。可通過降低誘導表達的培養溫度來增加可以溶性蛋白的表達量，以增加pET-28b（+）-e 的溶菌活性[11-13]。pET-28b（+）-e 的蛋白粗提液表現出對TBS 的偏好性，在PBS 中，溶菌活性被完全抑制了。

很多噬菌體進入宿主機體的關鍵步驟就是通過溶菌酶打開細菌細胞壁肽聚糖的多種共價鍵，使肽聚糖降解，造成細菌的死亡，這種能力在人類病原菌治療、食品、植物病害防治等方面有著很大的開發利用價值[14-15]。所研究的裂解基因e 和溶菌酶基因在理化性質上有很多相似的地方，所做的研究也為進一步了解噬菌體病毒包裝機制奠定了基礎。