高職高專院校黃酮類物質提取實驗教學設計
——以槐米中蘆丁的提取工藝為例

馮文婕

(浙江經貿職業(yè)技術學院應用工程學院，浙江 杭州 310018)

天然產物提取分離實驗課程的任務是介紹各種天然產物的物理、化學性質，結合物質特性選擇適宜的提取分離技術進行天然產物的制備，通過實驗教學使學生掌握常見天然產物的制備工藝和原理，培養(yǎng)學生生產實踐的能力[1-2]。

蘆丁是一種常見的黃酮類天然產物，也是槐米的主要的功能性成分，槐米中蘆丁含量一般在12%～20%[3]。蘆丁具有顯著的抗氧化活性、抗腫瘤、抗病毒等功效，常常用于開發(fā)各類功能性產品。醫(yī)藥工業(yè)方面也常常利用蘆丁為原料，開發(fā)心腦血管疾病方面的治療藥物[4-5]。由于蘆丁具有非常廣泛的生理和藥理活性，學習并掌握蘆丁的提取工藝技術具有重要的意義。同時，蘆丁具有黃酮類化合物典型的理化性質，《槐米中蘆丁的提取》這個實驗項目是一個比較典型的黃酮類化合物提取分離的綜合性實驗，可以通過學習槐米中蘆丁的提取制備，掌握黃酮類化合物的主要提取工藝技術[6]。

黃酮類化合物分子內由于含有酚羥基而呈弱酸性，提取黃酮類化合物最常用的方法是堿提酸沉法，即先用堿性溶液提取，再加酸酸化后沉淀析出；由于黃酮類化合物大多具有較大極性也可選擇乙醇等極性溶劑回流提取[7-8]。因此本實驗項目教學設計以槐米為原料，通過堿提酸沉法、乙醇回流提取法等工藝方法提取蘆丁，比較不同提取工藝條件對槐米中蘆丁的提取效率的影響。同時通過拓展實驗對比分析超聲輔助提取法、微波輔助提取法等其他提取工藝的優(yōu)劣。

1 實驗方案設計

本實驗方案共計8個學時，包括蘆丁的提取、蘆丁的分離純化、蘆丁的定性定量分析3個實驗項目，以及超聲輔助法提取蘆丁或微波輔助法提取蘆丁1個拓展實驗項目。通過蘆丁的提取掌握堿提酸沉法、乙醇回流提取法提取黃酮類化合物的工藝技術，掌握堿提酸沉法中溶液pH值的控制、乙醇濃度等工藝條件的選擇；通過蘆丁的純化，了解重結晶分離純化的方法和技術要點；通過蘆丁的定性定量分析，學會評價工藝的優(yōu)劣，選擇出最佳工藝條件；通過拓展實訓項目了解更多、更新的提取工藝方法。整個實驗內容綜合了黃酮類化合物提取、分離、純化、鑒別和測定等多個知識點和技能點，有利于學生綜合實踐應用技能的訓練和培養(yǎng)。

2 實驗項目操作方案

2.1 實驗原理

蘆丁是多羥基黃酮化合物，因含有酚羥基而具有酸性，易溶于堿性溶液生成弱酸強堿鹽，再加入酸和鹽反應，生成游離態(tài)的黃酮，并逐漸沉淀析出。

2.2 實驗材料與儀器

2.2.1 實驗材料和試劑

實驗原料為槐米；實驗試劑包括：蘆丁對照品；乙醇(分析純)；鹽酸(分析純)；硝酸鋁(分析純)；亞硝酸鈉(分析純)；碳酸氫鈉(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；石灰乳；鋅粉(或鎂粉)；蒸餾水。

2.2.2 實驗儀器

萬分之一電子天平；電爐、回流提取裝置、恒溫水浴鍋；可見紫外分光光度計；真空干燥箱；真空泵；普通玻璃儀器若干。

2.3 蘆丁的提取工藝

開展實驗教學時，全班30人為例，以3人為一個小組，開展實驗，不同的小組按照不同的提取工藝條件進行實驗，最后全班各小組對比提取率和得率，得出最佳提取工藝條件，并分析討論原因。

稱取槐米20 g，分別采用堿提酸沉法、乙醇回流提取法、堿性乙醇回流提取法等不同提取工藝條件提取槐米中的蘆丁。具體操作步驟如下：

堿提酸沉法：稱取槐米20 g置于500 mL燒杯中，加人蒸餾水300 mL，在攪拌下加入石灰乳，調節(jié)pH值使溶液呈堿性，然后電爐絲加熱至微沸，保持30 min(注意及時補充揮發(fā)的水分以保持溶液pH值不變)，趁熱紗布過濾。待溶液冷卻至 60～70 ℃時，用濃鹽酸調節(jié)溶液pH值至酸性，靜止待蘆丁沉淀析出，濾出結晶沉淀，烘干稱重。

乙醇回流提取法(或堿性乙醇回流提取法)：稱取槐米20 g置于圓底燒瓶中，加入一定量的乙醇溶液(或含碳酸氫鈉的堿性乙醇溶液)，并在中水浴加熱回流提取60 min，趁熱紗布過濾，用濃鹽酸調節(jié)溶液pH值至酸性，靜止待蘆丁沉淀析出，濾出結晶沉淀，烘干稱重。

各方法具體提取工藝條件見表1所示。

表1 分組開展槐米中蘆丁提取的工藝條件Table 1 Technological conditions of rutin extraction from sophora japonica in groups

堿提酸沉法重點分析堿提的pH值和酸沉的pH值對于提取效果的影響，并通過實驗結果討論分析，過酸或過堿對于提取效率的影響。乙醇回流提取法，重點分析討論料液比和乙醇濃度對于提取效率的影響，以及堿性條件下是否更有利于提高乙醇回流提取效率。

2.4 蘆丁過的分離純化

將沉淀結晶放入燒杯中，加人適量蒸餾水加熱至全部溶解并保持微沸15 min，然后趁熱抽濾，將濾液冷卻靜置，析出結晶后，再抽濾，并將結晶在60～70 ℃ 下干燥，得到精制蘆丁。

2.5 產品的定性定量分析

2.5.1 產品的定性分析

在提取、分離純化等各個環(huán)節(jié)結束后對提取產品進行定性分析，蘆丁是黃酮苷類物質，因此蘆丁的顯色反應同時滿足黃酮類的顯色反應和苷類的顯色反應。

鹽酸-鋅粉(鎂粉)反應：取少量結晶于試管中，用少量95%乙醇溶液溶解，加入少量鋅粉(或鎂粉)，滴加幾滴濃鹽酸，1～2 min內，觀察顏色變化，必要時可加熱反應。由于蘆丁屬于黃酮類物質，鹽酸-鋅粉(鎂粉)反應后會溶液會呈現(xiàn)紅色或粉紅色。

α-萘酚反應：取少量結晶于試管中，用少量95%乙醇溶液溶解，加入1 mL10%α-萘酚溶液，傾斜試管，搖勻，沿管壁緩慢滴加1 mL濃硫酸，不要震蕩，注意觀察兩界面產生的變化。由于蘆丁是黃酮苷類物質，分子里除了含有黃酮母核，還有含糖基，故進行α-萘酚反應時，溶液兩層界面之間會有紫環(huán)產生。

2.5.2 蘆丁標準曲線制作

先將蘆丁對照品放置在105 ℃干燥箱中干燥，精密稱量 20 mg，放置于100 mL容量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度，接著移液管吸取3，4，5，6，7 mL，分別加入到25 mL的容量瓶中，再加入1 mL的5%NaNO2溶液，混合6 min后，再加入1 mL的1.0% Al(NO3)3，混合6 min后，加入10 mL的4%NaOH，最后用60%乙醇溶液至刻度，混合10 min后在512 nm處測定吸光度，并繪制標準曲線。標準曲線的制作可以由值日生完成，供全班同學用。

2.5.3 產品的蘆丁含量的測定

精密精制后的蘆丁產品20 mg，放置于100 mL容量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度后，吸取3 mL加入到25 mL的容量瓶中，再加入1 mL的5%NaNO2溶液，混合6 min后，再加入1 ml的1.0%的Al(NO3)3，混合6 min后，加入10 mL的4%NaOH，最后用60%乙醇溶液至刻度，混合10 min后在512 nm處測定吸光度，并計算蘆丁的含量。

2.5.4 提取率和得率的計算

通過蘆丁的提取效率來作為提取工藝條件的評價指標，通常包括提取率和得率兩項指標[9-10]。其中得率和提取率計算公式如下：

(1)

(2)

3 拓展實驗

超聲波輔助提取法提取蘆丁，主要利用超聲波輻射產生的強烈的空化效應、界面效應、湍流效應和聚能效應等作用，破壞原來細胞，促進細胞內含物的溶出和傳遞，有利于低溫下快速提取的目標產物。可以在超聲波輔助情況下，進行堿提酸沉法或乙醇提取法，加快提取效率。

微波輔助提取法提取蘆丁，主要通過微波加熱輔助堿提酸沉法，利用的是微波的熱效應來促進介質轉動和能級躍遷。同時，微波具有較強的穿透力，且選擇性高等優(yōu)點，有利于提高產品的提取效率。

拓展實驗部分的實驗教學主要以教師講解和演示實驗為主。通過演示實驗學習超聲輔助法、微波輔助提取法的主要實驗原理、操作步驟和操作要點等。

4 實驗效果評估

本實驗設計符合高職高專類院校天然產物提取分離課程的教學要求，通過實驗教學，學生能夠較系統(tǒng)地、完整地掌握黃酮類化合物提取工藝技術。通過實操實驗和演示實驗掌握多種提取工藝，并分析各提取工藝的優(yōu)缺點；通過小組橫向對比分析，得出最佳提取工藝條件。

堿提酸沉法提取黃酮類物質時，關鍵在于控制溶液的酸堿度，過酸過堿都會降低提取效率。通過小組實驗結果比對可以幫助學生更好地理解這一關鍵點，同時得出最佳的酸堿度。乙醇回流提取和堿性乙醇回流提取法提取黃酮類物質時，關鍵在于乙醇濃度和料液比。通過小組實驗結果對比分析，可以得出最佳的提取條件。通過分組按照不同工藝條件實訓，每個同學在掌握兩個最主要的提取工藝的前提下，各組橫向對比，討論分析最佳提取條件。這也要求每個小組的成員要認真完成每一個實訓內容，才能獲得準確的實訓數據供大家分析。

5 結 語

本實訓項目教學設計以槐米為原料，通過堿提酸沉法、乙醇回流提取法等工藝方法提取蘆丁，比較不同提取工藝條件對槐米中蘆丁的提取效率的影響。同時通過拓展實驗對比分析超聲輔助提取法、微波輔助提取法等其他提取工藝的優(yōu)劣。該實訓項目綜合性較強，在培養(yǎng)學生掌握黃酮類提取工藝技術的同時，培養(yǎng)學生的主觀能動性和綜合分析能力，有利于培養(yǎng)學生的工匠精神。教學環(huán)節(jié)設計方面，突出各小組團隊合作，有利于培養(yǎng)學生的集體意識和團隊合作精神。