磁性分子印跡技術(shù)在藥物分析學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用*

陳振羽，郭亞甜，張儀恒，張宇欣，張育珍，2，秦 蓓，2，張 博，2

(1 西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2 西安醫(yī)學(xué)院藥物研究所，陜西 西安 710021)

左氧氟沙星(Levofloxacin，Lev)是一種喹諾酮類(lèi)抗菌素，具有抑菌范圍廣，抗菌活性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在呼吸道、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、皮膚軟組織等感染方面有良好療效[1-2]。隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，該藥品被廣泛的應(yīng)用在動(dòng)物飼養(yǎng)中，用以預(yù)防和治療相關(guān)感染，然而該藥物通過(guò)代謝傳遞，會(huì)殘留于各種奶制品中，由于嬰幼兒常年食用配方奶粉，導(dǎo)致左氧氟沙星轉(zhuǎn)入小孩體內(nèi)，產(chǎn)生惡心、腹瀉、頭暈失眠、皮膚過(guò)敏、尤其是骨骼發(fā)育等諸多不良反應(yīng)，對(duì)嬰幼兒健康造成不可忽視的潛在威脅，但是，傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)如熒光光譜法、色譜分析法，紫外光譜法等還存在樣品前處理繁瑣、靈敏度低、選擇性差等原因，迫切建立一種簡(jiǎn)便而且能夠高效識(shí)別檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中左氧氟沙星的定量方法[3-5]。

磁性表面分子印跡技術(shù)(Magnetic Surface Molecularly Imprinted Technique，MSMIT)，是以固相基質(zhì)為載體并在其表面進(jìn)行聚合反應(yīng)，以生命科學(xué)理論中酶與底物間的“鎖-鑰原理”為模型，合成與模板分子在空間結(jié)構(gòu)和功能基團(tuán)排布上高度吻合的三維空穴，并賦予磁性分離響應(yīng)而建立起的一種特異性分離檢測(cè)技術(shù)。該方法克服了傳統(tǒng)分子印跡聚合物對(duì)模板分子包埋過(guò)深、傳質(zhì)速率慢、分離效率低等缺點(diǎn)，通過(guò)三維空穴的“記憶效應(yīng)”，可以很好的識(shí)別復(fù)雜體系中的模板分子，通過(guò)外加磁場(chǎng)快速分離，高效地開(kāi)展對(duì)復(fù)雜體系中目標(biāo)分子的分離檢測(cè)工作，具有選擇性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、干擾小、重復(fù)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)[6-7]。

本次研究型創(chuàng)新綜合實(shí)驗(yàn)規(guī)劃：(1)查閱文獻(xiàn)，了解磁性表面分子印跡技術(shù)的選擇性吸附機(jī)理；(2)拓展知識(shí)，了解國(guó)內(nèi)外動(dòng)態(tài)，論述本項(xiàng)目意義；(3)設(shè)計(jì)并討論實(shí)驗(yàn)方案；(4)開(kāi)展材料合成、表征以及吸附分離工作；(5)Origin作圖以及數(shù)據(jù)分析[8-11]。

本次研究型創(chuàng)新綜合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：采用熱溶劑法制備Fe3O4納米磁球[12-14]，包裹硅膠并引入雙鍵，以此為載體材料，左氧氟沙星為模板分子，衣康酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，2，2-偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，制備對(duì)左氧氟沙星具有特異性吸附的磁性表面分子印跡聚合物，利用該磁性聚合物對(duì)奶粉樣品中左氧氟沙星進(jìn)行分離富集，開(kāi)發(fā)一種新的磁性印跡分離材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；T09-1S恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；CMD-20X智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SB—5200 DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DZF-6020真空干燥箱，上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TS-211B氣浴搖床，上海島析實(shí)業(yè)有限公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀，北京布魯克科技有限公司；Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

左氧氟沙星(Levofloxacin，簡(jiǎn)寫(xiě)Lev，99%)，武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司；三氯化鐵 天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙酸鈉、檸檬酸三鈉、α-甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AM)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2，2-偶氮二異丁腈(AIBN，98%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，99%)、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS，97%)、衣康酸(IA，99%)、甲基丙烯酰胺(98%)、4-乙烯基吡啶(4-VP，96%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、戊二醛(GA)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAAm)、乙腈、冰乙酸、正硅酸乙酯(TEOS)，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 磁性表面分子印跡聚合物的制備

1.2.1 Fe3O4的制備

稱量1.35 g FeCl3·6H2O于平底燒瓶中，加入40 mL乙二醇，磁力攪拌使之溶解變?yōu)槌赛S色液體；然后加入3.1 g無(wú)水乙酸鈉，繼續(xù)攪拌至深黃色；再稱取0.4 g檸檬酸三鈉于平底燒瓶中，攪拌30 min；將溶液轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯水熱反應(yīng)釜中，在烘箱中200 ℃下反應(yīng)8 h。待反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)釜并冷卻至室溫，棄去上清液，將制成的黑色沉淀轉(zhuǎn)移到燒杯里，用去離子水和甲醇交替洗滌三次，磁性分離，在50 ℃真空減壓干燥4 h以上即得Fe3O4納米磁球。

1.2.2 Fe3O4@SiO2的制備

稱取上述Fe3O4納米磁球400 mg分散于160 mL無(wú)水乙醇和40 mL去離子水的混合溶液中，超聲30 min，直至觀察不到聚集現(xiàn)象，然后加入4 mL NH3·H2O使溶液呈堿性，再緩慢逐滴滴加3 mL TEOS，繼續(xù)超聲聚合反應(yīng)1 h，中途搖晃瓶身防止底部聚沉。將得到的產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用去離子水和甲醇交替洗滌三次，在50 ℃真空減壓干燥4 h以上即得Fe3O4@SiO2納米磁球。

1.2.3 Fe3O4@SiO2@MPS的制備

稱量200 mg的Fe3O4@SiO2納米磁球于儲(chǔ)液瓶中，加入80 mL乙醇和80 mL水并超聲30 min，再加入0.5 mL的MPS繼續(xù)超聲并緩慢滴加2.0 mL氨水，置于搖床中，在60 ℃、150 rpm下振蕩反應(yīng)7 h。待反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行磁性分離，將制得的磁性納米粒子用去離子水和甲醇交替洗滌三次，在50 ℃真空減壓干燥4 h以上即得Fe3O4@SiO2@MPS納米磁球。

1.2.4 Lev-MMIPs與MNIPs的制備

稱取0.1 mmol的左氧氟沙星于平底燒瓶中，加入50 mL的甲醇使其溶解，然后加入0.4 mmol衣康酸，室溫下預(yù)聚合2 h；隨后加入50 mg用甲醇超聲分散均勻的Fe3O4@SiO2@MPS納米磁球，放入搖床中，在30 ℃、150 rpm振蕩組裝1 h；再加入1 mmol交聯(lián)劑EGDMA和20 mg引發(fā)劑AIBN，在N2保護(hù)下于搖床中60 ℃、150 rpm聚合反應(yīng)20 h。反應(yīng)結(jié)束后，將合成的印跡材料進(jìn)行磁性分離，用甲醇和去離子水交替洗滌三次，在50 ℃真空減壓干燥1 h。然后用200 mL甲醇：冰乙酸(8:2，V/V)溶液索氏提取洗脫24 h洗脫除去模板分子。最后，用甲醇合成材料洗至無(wú)酸味，60 ℃下真空減壓干燥即得磁性表面分子印跡聚合物，簡(jiǎn)寫(xiě)Lev-MMIPs。

在不加入模板分子的情況下，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟制備對(duì)照聚合物MNIPs。

1.3 奶制樣品的前處理及應(yīng)用

稱取2 g嬰幼兒配方奶粉于20 mL溫水中超聲溶解，精確吸取5 mL溶液于25 mL容量瓶中，再加入一定體積的左氧氟沙星儲(chǔ)備液，用甲醇定容到刻度線，混勻后倒入離心管，渦旋混勻30 s，于8000 rpm離心15 min，取上清液即得處理好的奶制樣品。

1.4 高效液相色譜(HPLC)分析

色譜條件：Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀； Agilent HC-C18(4.6×150 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：水相為0.1%甲酸水溶液(A)，有機(jī)相為10%乙腈甲醇溶液(B)，梯度洗脫 (0～2.00 min，A:B=80%:20%；2.01～4.00 min，A:B=70%:30%；4.00～10.00 min，A:B=50%:50%；10.01～12.00 min，A:B=80%:20%)；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

移取3 mL加標(biāo)樣品于5 mL離心管中，加入10 mg磁性印跡材料，震蕩吸附1 h，然后磁性分離，用1 mL洗脫液(10%冰乙酸甲醇溶液)洗脫30 min，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性印跡聚合物的制備

2.1.1 功能單體的考察

Lev-MMIPs的吸附能力依賴于許多不同的因素，其中功能單體通過(guò)氫鍵與模板分子作用，在立體空間中，不同功能單體與模板分子作用強(qiáng)弱不同，表現(xiàn)出吸附容量的差異，同時(shí)由于三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)型，也表現(xiàn)出選擇性的大小，兩者共同影響印跡材料對(duì)模板分子的選擇性和吸附容量，是合成材料的關(guān)鍵因素。在考察功能單體的過(guò)程中，加入左氧氟沙星0.1 mmol，交聯(lián)劑1 mmol，引發(fā)劑20 mg，選擇丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)、衣康酸(IA)、甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMA)、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAM)共7種功能單體制備相應(yīng)的磁性印跡聚合物，以吸附容量Q作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)Lev-MMIPs對(duì)Lev的特異性吸附能力，見(jiàn)表1所示。

表1 功能單體的考察Table 1 Investigation of functional monomers

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同其它實(shí)驗(yàn)條件下，衣康酸作為功能單體吸附容量最大，可以說(shuō)明當(dāng)衣康酸作為功能單體時(shí)，對(duì)左氧氟沙星的選擇性吸附最好，所以本文選擇其作為制備磁性表面分子印跡聚合物的最佳功能單體。

2.1.2 致孔劑的考察

反應(yīng)溶劑也稱為致孔劑，在反應(yīng)體系中，溶解模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等，同時(shí)分散Fe3O4@SiO2@MPS納米磁球，合適的致孔劑可以很好的促進(jìn)表面聚合反應(yīng)，有利于三維空穴的形成，影響Lev-MMIPs的吸附容量，所以研究中選擇7種溶劑:甲醇、甲醇:水(1:1，V/V)、乙腈、乙腈:水(1:1，V/V)、DMF、DMF:水(1:1，V/V)、甲醇:乙腈(1:1，V/V)制備Lev-MMIPs磁性印跡材料，以吸附容量Q作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)Lev-MMIPs對(duì)Lev的吸附效果，見(jiàn)表2所示。

表2 致孔劑的考察Table 2 Investigation of pore forming agent

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同其它條件下，以甲醇作為致孔劑制備的Lev-MMIPs對(duì)Lev具有最優(yōu)的吸附容量。因此本文選擇甲醇作為合適的致孔劑。

2.1.3 交聯(lián)劑的考察

交聯(lián)劑在印跡聚合物膜的形成過(guò)程中有著支撐骨架效應(yīng)，交聯(lián)劑過(guò)多使得聚合反應(yīng)速率過(guò)快，導(dǎo)致材料成絮狀，過(guò)于蓬松，使得聚合物嚴(yán)重團(tuán)聚，同時(shí)磁性消失；交聯(lián)劑過(guò)少使得聚合反應(yīng)不完全，印跡聚合物膜不易形成，同時(shí)形成空穴過(guò)少，吸附容量過(guò)低，因此交聯(lián)劑在磁性表面分子印跡聚合物的合成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在本研究中，固定模板分子和功能單體的用量，分別加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAAm)、戊二醛(GA)3種交聯(lián)劑各1 mmol制備相應(yīng)的磁性印跡聚合物，以吸附容量Q作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)Lev-MMIPs對(duì)Lev的吸附性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)模板分子:功能單體:交聯(lián)劑=1:4:10時(shí)，選擇性吸附最好，所以后續(xù)采用該優(yōu)化比例制備吸附材料用于實(shí)驗(yàn)研究，見(jiàn)表3所示。

表3 交聯(lián)劑的考察Table 3 Investigation of crosslinking agent

2.2 磁性印跡聚合物的表征

2.2.1 TEM表征分析

通過(guò)表面聚合反應(yīng)，在最優(yōu)比例條件下制備出磁性表面分子印跡聚合物，該材料呈球形，單分散性良好，具有清晰的核-殼結(jié)構(gòu)，內(nèi)部黑色部分為磁性Fe3O4核，約160 nm，外部為聚合物層，整體粒徑約200 nm，印跡層位于外表面，吸附過(guò)程中傳質(zhì)速率快，可有效減少“包埋”現(xiàn)象，提高選擇性吸附容量，見(jiàn)圖1所示。

圖1 Lev-MMIPs透射電鏡圖Fig.1 The TEM image of Lev-MMIPs

2.2.2 紅外光譜分析

對(duì)Fe3O4、Fe3O4@SiO2、MMIPs進(jìn)行紅外光譜表征。由裸磁球Fe3O4的紅外光譜曲線(圖2a)可以看出，586 cm-1附近出現(xiàn)的特征峰歸屬于Fe-O的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明Fe3O4制備成功；在Fe3O4@SiO2的吸收曲線(圖2b)中出現(xiàn)1110 cm-1的特征峰，是典型的Si-O-Si伸縮振動(dòng)吸收峰，結(jié)合TEM圖可以證明二氧化硅層很好的包裹于Fe3O4的外側(cè)；在印跡材料的紅外光譜曲線(圖2c)中，可以看到1730 cm-1出現(xiàn)很明顯的特征吸收峰，該峰歸屬于交聯(lián)劑和功能單體中的C=O，而1400 cm-1附近的特征峰則是印跡層中大量C-O伸縮振動(dòng)所致，3131 cm-1處的寬吸收峰，則歸屬于衣康酸羧基中的-OH。三者光譜圖分析對(duì)比可以看出，通過(guò)聚合反應(yīng)，成功地合成了磁性表面分子印跡聚合物，見(jiàn)圖2所示。

圖2 紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra

2.3 磁性印跡聚合物對(duì)左氧氟沙星的分離富集

為了驗(yàn)證合成印跡材料對(duì)實(shí)際樣品中左氧氟沙星的選擇性吸附效果，研究中分別配制嬰幼兒配方奶粉空白溶液、以及加標(biāo)模擬樣品溶液，采用1.4方法分離富集并進(jìn)行色譜分析，見(jiàn)圖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，圖3a為空白樣品圖，其中雜質(zhì)多而且基線噪音大；圖3b為加標(biāo)樣品，出現(xiàn)了左氧氟沙星色譜峰，空白處幾乎無(wú)干擾；圖3c為采用合成的磁性印跡材料吸附，然后洗脫富集所得結(jié)果。由此可以看出，背景噪音降低、樣本雜質(zhì)基本都被剔除，左氧氟沙星信號(hào)明顯提高，可以說(shuō)明合成的磁性表面分子印跡聚合物對(duì)奶粉樣品中的左氧氟沙星有很好地分離富集效果。

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 Chromatograms of HPLC

2.4 研究型綜合實(shí)驗(yàn)運(yùn)行模式探討

2.4.1 文獻(xiàn)查閱與批閱

藥學(xué)本科生中大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目的開(kāi)展，對(duì)在校大學(xué)生培育創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目有很好地支撐效果，也對(duì)大學(xué)生日后的科學(xué)研究興趣和研究思維具有很好地啟蒙作用，同時(shí)也反哺理論教學(xué)，使學(xué)生對(duì)本專業(yè)知識(shí)以及學(xué)科前沿有更高層次理解，激發(fā)學(xué)生興趣，調(diào)動(dòng)學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)潛能。為了使學(xué)生很好地認(rèn)識(shí)項(xiàng)目，結(jié)合本科生時(shí)間有限的特點(diǎn)，建立QQ討論群，安排每名學(xué)生每周查閱文獻(xiàn)兩篇，研讀并做好讀書(shū)筆記，然后上傳QQ群，項(xiàng)目組學(xué)生共享，指導(dǎo)老師對(duì)每篇文獻(xiàn)進(jìn)行批閱，用來(lái)指導(dǎo)學(xué)生，掌握學(xué)生看文獻(xiàn)的領(lǐng)域是否正確，內(nèi)容是否相關(guān)，有沒(méi)有可借鑒之處，創(chuàng)新點(diǎn)是什么等幫助學(xué)生、扶持學(xué)生走向正軌。

2.4.2 運(yùn)用PBL教學(xué)法指導(dǎo)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)

以問(wèn)題為導(dǎo)向的教學(xué)方法(problem-based learning，PBL)，是基于現(xiàn)實(shí)世界的以學(xué)生為中心的教育方式[15-16]。該方法通常被用于教學(xué)的過(guò)程中，而在本項(xiàng)目的執(zhí)行過(guò)程中，我們采用該方法，收集實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中的各種問(wèn)題，然后集中討論，達(dá)成共識(shí)，再去落實(shí)實(shí)驗(yàn)研究，很好地推動(dòng)了學(xué)生實(shí)驗(yàn)研究的開(kāi)展。本項(xiàng)目研究過(guò)程中，共有合成、表征、分離富集三個(gè)方面，共收集10問(wèn)題加以討論，比如：“功能單體有哪些”、“ 吸附的作用力是什么”、“表征材料的方法有哪些”、“氮?dú)獗Ｗo(hù)的操作如何實(shí)現(xiàn)”等，很好的從操作和理論兩方面給學(xué)生充分的指導(dǎo)，保證學(xué)生順利完成項(xiàng)目?jī)?nèi)容。

2.4.3 作圖、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析

作圖、數(shù)據(jù)處理以及每一步結(jié)果分析，對(duì)學(xué)生和后續(xù)實(shí)驗(yàn)都很重要。在大創(chuàng)項(xiàng)目落實(shí)的過(guò)程中，我們對(duì)Origin、ChemDraw、3DMax、Excel等軟件進(jìn)行了集中培訓(xùn)，提供一些數(shù)據(jù)學(xué)生練習(xí)，老師指導(dǎo)，手把手教會(huì)學(xué)生如何作圖、制表、處理數(shù)據(jù)等。在項(xiàng)目期間，要求學(xué)生一邊做實(shí)驗(yàn)，一邊通過(guò)作圖形象地表達(dá)研究?jī)?nèi)容，及時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這樣不僅僅很好地完成了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，而且提高了學(xué)生繪圖、分析數(shù)據(jù)的能力，很好地完成了項(xiàng)目?jī)?nèi)容。

3 結(jié) 論

磁性表面分子印跡聚合物在樣品分離富集過(guò)程中特異性強(qiáng)，檢測(cè)濃度低，能有效地改善樣品中痕量分析的諸多不足。本文以雙鍵修飾后的Fe3O4@SiO2作為支撐材料，左氧氟沙星為模板分子，衣康酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，2，2-偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，甲醇為致孔劑合成制備了Lev-MMIPs磁分子印跡材料，并對(duì)嬰幼兒配方奶粉中加標(biāo)左氧氟沙星開(kāi)展了分離富集效果驗(yàn)證。通過(guò)研究型創(chuàng)新綜合實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，促進(jìn)學(xué)生掌握磁性印記聚合物的制備、原理、表征、吸附性能研究等，培養(yǎng)學(xué)生查閱文獻(xiàn)解決問(wèn)題、規(guī)范儀器操作、培育創(chuàng)新思維、開(kāi)拓研究領(lǐng)域眼界等，提高學(xué)生繪圖、制表、分析數(shù)據(jù)等水平，提高藥學(xué)本科生的科研綜合能力，落實(shí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目開(kāi)展。