間苯三酚分光光度法測定燕窩中的海藻酸鈉

李 丹，李國棟，張亞云

(1 至睿生物(江蘇)有限公司，江蘇 太倉 215400；2 蘇州珩悅環保工程有限公司，江蘇 太倉 215400;3 江蘇國測檢測技術有限公司，江蘇 昆山 215300)

海藻酸鈉是一種常用的食品添加劑[1-2]，是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產物[3-4]，是一種天然多糖[5-6]。由于其水溶液具有較高的黏度，因此在食品行業常被用作增稠劑[7]、穩定劑[8]、乳化劑等。在燕窩中適量添加海藻酸鈉，可以使燕窩口感柔滑[9]、細膩，在攪拌時有粘性[10-11]，并有遲滯感。國標GB 1886.243-2016 《食品安全國家標準 食品添加劑 海藻酸鈉(又名褐藻酸鈉)》中有對海藻酸鈉的鑒別試驗，但僅能對其定性、不能定量，且所需的試樣溶液濃度較高，而作為添加劑的海藻酸鈉在燕窩中含量較低，檢測效果不明顯。目前還沒有關于海藻酸鈉作為食品添加劑定量測定其含量的國家標準[12]，而余德壽在《海藻酸鈉測定 分光光度法》一文中提到，海藻酸鈉由β-D甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸按(1→4)鍵連接而成，分子中的醛基物質能與間苯三酚反應生成黃色絡合物，其色澤的深淺與海藻酸鈉含量呈正相關關系[13]。因此，本文在其研究的基礎上，研究了間苯三酚分光光度法[14]測定燕窩中海藻酸鈉含量的方法。實驗中探討了與海藻酸鈉反應的最佳間苯三酚的加入量，鹽酸加入量的影響[15-16]，酸性條件下海藻酸鈉與間苯三酚的水浴反應時間的確定[17]，顯色后黃色絡合物的穩定時間[18]，以及黃色絡合物的最大吸收波長。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 儀器

UV-1100紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；FA 2004電子天平，邦西儀器科技(上海)有限公司。

1.1.2 試劑

間苯三酚(25 g，麥克林)溶液：稱取1.000 g間苯三酚，溶于無水乙醇，定容至100 mL；海藻酸鈉(25 g，麥克林)標準儲備液：稱取0.200 g海藻酸鈉，用熱水溶解后，轉移至100 mL容量瓶并定容(使用液：稀釋成0.2 g/L)；鹽酸(500 mL)，江蘇強盛功能化學股份有限公司；碳酸鈉(500 g)，南京化學試劑股份有限公司。

以上試劑均為分析純或優級純，所用水為三級去離子水。

1.1.3 材料

市售的某品牌燕窩。

1.2 實驗條件

1.2.1 測定原理

以間苯三酚溶液為顯色劑，海藻酸鈉在酸性條件下，分子中的醛基物質與間苯三酚在沸水浴中反應生成黃色絡合物，在440 nm吸收波長下測定吸光度。通過標準曲線計算出海藻酸鈉的含量。

1.2.2 標準曲線的繪制

取10 支25 mL比色管，依次加入0.00 mL，0.50 mL，0.75 mL，1.00 mL，1.25 mL，1.5 mL，1.75 mL，2.00 mL，2.25 mL，2.50 mL[13]海藻酸鈉標準使用液，分別加入10.00 mL鹽酸，混勻后各加入0.70 mL間苯三酚溶液，混勻，置于沸水浴中顯色反應65 min，取出后用流水降至室溫，定容至刻度，以空白管為參比，在440 nm處測定其吸光度。以海藻酸鈉含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 樣品的測定

移取2.00 mL燕窩試樣于100 mL容量瓶，加入1.000 g固體碳酸鈉[19-20]，在85 ℃水浴條件下加熱3 h，取出冷卻后過濾。移取1.00 mL濾液于25 mL比色管中，使之按照1.2.2中步驟操作，測定吸光度。通過吸光度代入標準曲線即可得出海藻酸鈉含量。

2 結果與討論

2.1 實驗條件確定

2.1.1 吸收波長

取1.00 mL海藻酸鈉標準使用液，加10.00 mL鹽酸，混勻后加0.70 mL間苯三酚溶液，混勻，置于沸水浴中顯色反應 65 min，取出用流水冷卻后定容，在不同波長下測定其吸光度。由圖1可以看出，海藻酸鈉的最大吸收波長為440 nm。

圖1 吸收波長對吸光度的影響Fig.1 Effect of absorption wavelength on absorbance

2.1.2 顯色劑用量

分別吸取不同體積的顯色劑，按上述條件進行操作并對海藻酸鈉含量進行測定，研究顯色劑用量對測定的海藻酸鈉含量的影響。圖2的結果表明，隨著顯色劑用量的增加，海藻酸鈉測定值增大。當顯色劑用量增加到0.70 mL以上時，海藻酸鈉測定值反而降低，這是因為過量的顯色劑與反應產物繼續發生作用，使反應過程逆向進行。因此，選用0.70 mL作為顯色劑用量的最佳條件。

圖2 顯色劑用量對吸光度的影響Fig.2 Effect of developer dosage on absorbance

2.1.3 酸性條件(鹽酸加入量)

分別加入不同的鹽酸量按上述條件進行操作并對海藻酸鈉含量進行測定，研究不同酸性條件對測定得出的海藻酸鈉含量的影響。由圖3可以看出，隨著鹽酸加入量的增加，海藻酸鈉測定值不斷增大。當鹽酸量增大到10.00 mL以上時，鹽酸已過量，測定出的海藻酸鈉含量出現降低的趨勢，這是因為反應溶液中逐漸出現黃棕色沉淀，即選取10.00 mL鹽酸量作為顯色反應的最佳酸性條件。

圖3 鹽酸加入量對吸光度的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid dosage on absorbance

2.1.4 水浴顯色時間

圖4 水浴時間對吸光度的影響Fig.4 Effect of water bath time on absorbance

分別選取不同的水浴顯色時間，用秒表計時，水浴顯色結束后立即用流水冷卻，按上述條件進行操作并對海藻酸鈉含量進行測定，分析水浴顯色時間對海藻酸鈉的影響。圖4結果表明，水浴顯色時間對海藻酸鈉含量的影響很大。隨著加熱時間的延長，測得的海藻酸鈉含量不斷增大，這是因為隨著反應時間的延長，顯色反應更加徹底。但當加熱到65 min之后，測得的海藻酸鈉含量逐漸降低，這可能是因為加熱時間過長，會發生一些副反應導致海藻酸鈉含量降低。由圖4可見，加熱 65 min時海藻酸鈉測定值最高，因此最佳條件下的水浴顯色時間為65 min。

2.1.5 顯色后的放置時間

按照上述條件，取出用流水冷卻后定容，通過不同的放置時間測定其吸光度，研究放置時間對海藻酸鈉含量的影響。由圖5的結果表明，放置時間在15 min以內時，測定的海藻酸鈉含量相對穩定，隨著放置時間的延長，海藻酸鈉的含量不斷增加，表明放置15 min之后，海藻酸鈉的含量不再穩定。因此顯色反應結束后應立即比色，且比色時間以不超過15 min為宜。

圖5 顯色后放置時間對吸光度的影響Fig.5 Effect of storage time on absorbance after color development

2.2 工作曲線與檢出限

方法線性方程為y=3.4609x+0.0148，r2=0.9996；線性范圍為0～0.5 mg。根據6次最低濃度點(0.1 mg)的測定值的標準差(S)，以3S計算求得方法的檢出限為0.03 mg/mL。

2.3 精密度實驗

分別配制海藻酸鈉標準溶液的含量為0.15 mg，0.30 mg，0.45 mg，重復測定6次。精密度測定結果如表1所示，海藻酸鈉的相對標準偏差在1.58%～3.78%之間，可滿足海藻酸鈉測定試驗的要求。

表1 海藻酸鈉精密度的測定結果Table 1 Determination results of precision of sodium alginate

2.4 樣品的加標回收率試驗

分別移取燕窩試樣(燕窩1含有海藻酸鈉、燕窩2不含海藻酸鈉)2.00 mL于100 mL容量瓶，每個樣品6份，加入海藻酸鈉標準使用液0.5 mL、1.25 mL、2.25 mL(每種濃度2個)，其余步驟同1.2.3；由6個測定結果計算得出燕窩中海藻酸鈉的含量，同時計算回收率，并得出6個回收率的平均值和RSD。結果顯示：燕窩1的海藻酸鈉加標回收率范圍在90.0%～104.0%，均值為96.2%，RSD為5.5%；燕窩2的海藻酸鈉加標回收率范圍在85.0%～97.8%，均值為92.7%，RSD為4.8%。

表2 海藻酸鈉含量及加標回收率的測定結果Table 2 Determination results of sodium alginate content and standard addition recovery

3 結 論

王澤文等在《褐藻酸鈉的分光光度法測試技術》中研究了采用銅試劑顯色分光光度法測定褐藻酸鈉的含量，該方法通過間接法測定，涉及試劑種類多，操作復雜。尚德榮等在《海帶中褐藻膠含量測定方法的建立》中研究了質量法和醋酸鈣法測定海帶中褐藻膠的含量，該法存在操作時間長、步驟多、雜質干擾等問題。

而本文研究了間苯三酚分光光度法測定燕窩中海藻酸鈉含量的方法，該法具有操作簡便、準確度高、精密度好等優點，為研究燕窩中海藻酸鈉的測定提供了可靠的技術方法，適用于實驗室檢測、工廠中產品質量的監測、海藻酸鈉降解監測等實際工作，具有推廣價值[21]。