氣血舒顆粒質量控制研究

夏小健，劉雨珍

(1 安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012; 2 馬鞍山市中醫院，安徽 馬鞍山 243021)

氣血舒服顆粒劑(簡稱氣血舒顆粒)是由白參、白術、茯苓、茯神、當歸、川芎、白芍、熟地黃、夜交藤、炙遠志、炙甘草11味中藥組成的復方制劑，是馬鞍山市中醫院團隊在經典名方四君子湯和四物湯復方基礎加入遠志、茯神、夜交藤佐使之用，以此作為腫瘤科使用的經典經驗方。方中人參與熟地相配，益氣養血，共為君藥。白術、茯苓健脾滲濕，助人參益氣補脾。當歸、白芍養血和營，助熟地滋養心肝，均為臣藥。川芎為佐，活血行氣，使地、歸、芍補而不滯。茯神、遠志、夜交藤寧心安神。炙甘草為使，益氣和中，調和諸藥。主治氣血虧虛型虛勞，是益氣補血、健脾安神的代表方劑，在臨床上得到較好的療效[1]。

中藥顆粒劑是在基于中醫藥理論的基礎上聯系臨床用藥的需求，將中藥材及其飲片加工而成的一種新劑型。顆粒劑既具有傳統中藥湯劑易于吸收、作用快的特點又能夠克服煎煮的以及攜帶的不便，在臨床上目前廣泛使用[2-4]。同時我們可以采用輔料添加或者薄膜包衣的形式提高藥物穩定性、達到在體內緩釋控釋等目的[5]。目前關于顆粒劑的制備研究也在不斷深入[6-7]以為臨床用藥方式提供參考，但關于中藥顆粒劑的質量標準研究卻沒有一個明確的標準[8-9]。氣血舒顆粒在臨床上沒有統一的質量標準，因此有必要對其進行質量標準研究。

TLC法可以很容易地對合成藥物復方制劑或單方制劑進行原料分析，在鑒別物質方面廣泛使用[10]，本方采用TLC法對氣血舒顆粒中除人參的10味藥進行定性鑒別。方中君藥人參中的主要活性成分人參皂苷作為定量指標，《中國藥典》2020年版只對人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb13種人參皂苷含量做出規定，質量控制指標少[11]，因此通過HPLC法進行人參皂苷Rg1、Rb1、Re的分離與含量測定，為氣血舒顆粒臨床質量標準提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent 1260高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；METTLER-TOLEDO AB204-SRS電子天平,瑞士METTLER公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司；紫外檢測儀等。

1.2 材 料

人參皂苷Rg1(批號110703-201731)、人參皂苷Re(批號110754-201827)、人參皂苷Rb1(批號110704-201827)、白術對照藥材(批號120925-201812)、茯苓對照藥材(批號121117-201107)、當歸對照藥材(批號120927-201617)、阿魏酸(批號110773-201915)、藁本內酯(批號111737-201608)、川芎對照藥材(批號120918-201411)、歐當歸內酯A(批號11826-201203)、芍藥苷(批號110736-201943)、毛蕊花糖苷(批號111530-201914)、首烏藤對照藥材(批號120939-201908)、大黃素(批號110756-201913)、遠志對照藥材(批號120989-201107)、細葉遠志皂苷(批號111849-201705)、甘草(脹果甘草)對照藥材(批號121303-201704)、甘草酸單銨鹽(批號110731-202021)；氣血舒顆粒劑自制(批號20201029、20201030、20201101)；各陰性顆粒劑亦自制。硅膠GF254薄層板、硅膠G薄層板、硅膠H薄層板；乙醇、甲醇等試劑為分析純；乙腈為色譜純；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 炒白芍的鑒別

(1)供試品溶液的制備[12]

取本品顆粒3 g，研缽研細，20 mL 水溶解，20 mL 飽和正丁醇萃取 2 次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇溶解定容至 2 mL，作為供試品溶液。

(2)對照藥品溶液的制備。

取芍藥苷對照品，加乙醇制成1 mg/mL溶液。陰性樣品溶液的制備：稱取2.14 g不含炒白芍的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備。

(3)鑒別

吸取上述新制備的3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

(4)結果

實驗結果見圖1所示。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍紫色斑點，而陰性樣品溶液無此相應斑點，亦無干擾。

圖1 實驗室條件下炒白芍薄層圖Fig.1 Thin layers of fried white peony under laboratory conditions

2.1.2 首烏藤的鑒別

(1)供試品溶液的制備

取本品顆粒2 g，研缽研細，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾液濃縮至1 mL。

(2)對照藥材溶液的制備

另取首烏藤對照藥材0.25 g，研缽研細，同法制成對照藥材溶液。對照藥品溶液的制備：取大黃素對照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液。

(3)陰性樣品溶液的制備

稱取1.07 g不含首烏藤的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

(4)鑒別[13]

吸取上述新制備的4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

(5)結果

實驗結果見圖2所示，供試品色譜中，在與對照品色譜相對應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾。

圖2 實驗室條件下首烏藤薄層鑒別結果Fig.2 Thin layer identification results of Radix Polygoni under laboratory conditions

2.1.3 白術的鑒別

(1)供試品溶液的制備

取本品顆粒7 g，研缽研細，加正己烷20 mL超聲15 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，取濾液即得。

(2)對照藥材溶液

取白術對照藥材1 g，加水煎煮1 h，濾過，濾液濃縮至 30 mL，乙酸乙酯振搖提取2 次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解。

(3)陰性樣品溶液的制備

稱取7.07 g不含炒白術的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

(4)薄層鑒別

吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮-甲酸(19∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下檢視，結果見圖3所示[14]。

(5)結果

白術對照藥材、氣血舒顆粒與不含白術的陰性顆粒在相應位置上均顯相同顏色的斑點，因而白術對照藥材不能將氣血舒顆粒陽性與陰性樣品鑒定開，建議不收入標準正文。

圖3 白術專屬性薄層圖Fig.3 Thin layer map of Atractylodes atractylodes specificity

2.1.4 茯苓與茯神的鑒別

(1)供試品溶液的制備

取顆粒7 g，加20 mL乙醇，超聲20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯溶解。

(2)對照藥材溶液的制備

取茯苓對照藥材粉末0.5 g，同法處理，作為對照藥材溶液。

(3)陰性樣品溶液的制備：

①不含茯苓與茯神的陰性樣品溶液1的制備：稱取5.78 g的不含茯苓與茯神的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液1。②不含茯苓的陰性樣品溶液2的制備：稱取6.75 g的不含茯苓的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備出陰性樣品溶液2。③不含茯神的陰性樣品溶液3的制備：稱取6.43 g的不含茯神的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備出不含茯神的陰性樣品溶液3。

(4)薄層鑒別

照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部 通則0502)試驗，吸取供試品溶液15 μL，對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-氯仿-丙酮-甲酸(9:3:1:0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

(5)結果

實驗結果見圖4所示。供試品色譜中，在與茯苓對照藥材色譜相應的位置上，氣血舒顆粒溶液、不含茯苓陰性顆粒、不含茯神陰性顆粒均顯相同顏色的斑點，不含茯苓與茯神的陰性顆粒溶液無斑點。

2.1.5 甘草的鑒別

(1)供試品溶液的制備

取本品顆粒14.78 g，研缽研細，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，濾過，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL溶解，正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL溶解，得供試品溶液。

(2)對照藥材溶液的制備

另取甘草對照藥材1 g，研缽研細，移至錐形瓶中，同法制成對照藥材溶液。

圖4 室溫條件下茯苓與茯神薄層鑒別結果Fig.4 Result of thin-layer identification of poria cocos and fushen at room temperature

(3)陰性樣品溶液的制備

稱取14.14 g不含炙甘草的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

(4)鑒別

吸取上述新制備的4種溶液各1～2 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

(5)結果

實驗結果見圖5所示。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品溶液無此相應斑點，亦無干擾。

圖5 室驗室條件下甘草薄層鑒別結果Fig.5 Identification of glycyrrhiza uralensis Fisch by TLC under laboratory conditions

2.1.6 當歸和川芎的鑒別[15]

(1)供試品溶液的制備

取本品顆粒15 g，研細，加乙酸乙酯 30 mL，超聲處理 30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。

(2)對照藥材溶液的制備

取當歸、川芎對照藥材各 1 g，加乙酸乙酯 30 mL，超聲處理 30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇 1 mL 使溶解，分別作為當歸對照藥材溶液與川芎對照藥材溶液。

(3)陰性樣品溶液的制備

取不含當歸、川芎的其他藥味，按處方比例制成缺當歸、川芎的陰性對照樣品溶液。

(4)鑒別

以環己烷- 乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，上行展開8 cm，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

(5)結果

結果見圖6所示，當歸對照藥材、川芎對照藥材薄層色譜圖相同，二者不能鑒別，二者與氣血舒顆粒在相應位置上均顯相同顏色的斑點，當歸與川芎對照藥材不能將氣血舒顆粒陽性與陰性樣品鑒定開，建議不收入標準正文。

圖6 當歸與川芎專屬性薄層圖Fig.6 Thin-layer map of the specificity of Angelica sinensis and Ligusticum chuanxiong

2.1.7 地黃的鑒別

(1)供試品溶液的制備

取本品顆粒7 g，置于研缽內，研細，移至錐形瓶中，加80%甲醇50 mL，超聲處理 30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。

(2)對照藥品溶液的制備

另取毛蕊花糖苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

(3)陰性樣品溶液的制備

稱取6.75 g不含熟地黃的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

(4)鑒別

吸取上述新制備的供試品溶液與陰性樣品溶液各5 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16:0.5:2)為展開劑，展開，取出，晾干，用0.1%的1，1-二苯基-2-苦肼基無水乙醇溶液浸漬，晾干。

(5)結果

實驗結果見圖7所示。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的顏色斑點。而陰性樣品溶液無此相應斑點，亦無干擾。

圖7 實驗室條件下熟地黃薄層鑒別結果Fig.7 Thin layer identification results of Rehmanniae rehmanniae under laboratory conditions

2.1.8 遠志的鑒別

(1)供試品溶液1的制備

取本品顆粒3.69 g，置于研缽內，研細，移至錐形瓶中，加70%乙醇5 mL，超聲處理15min，濾過，濾液作為供試品溶液1。

(2)對照藥材溶液的制備

另取遠志對照藥材0.5 g，置于研缽內，研細，移至錐形瓶中，同法制成對照藥材溶液。

(3)陰性樣品溶液1的制備

稱取3.37 g不含制遠志的陰性樣品，按照供試品溶液1制備方法制備陰性樣品溶液1。

(4)供試品溶液2的制備

取本品粉末(過三號篩)約7.39 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，置圓底燒瓶中，蒸干，殘渣加10%NAOH溶液50 mL，加熱回流2 h，放冷，用鹽酸調節pH值為4～5，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至25 mL最瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液2。

(5)陰性樣品溶液2的制備

稱取上述所制不含制遠志陰性樣品1共6.75g，按照供試品溶液2制備方法制備陰性樣品溶液2。

(6)對照品溶液的制備

取細葉遠志皂苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 1 mL含2 mg的溶液，即得。

(7)鑒別

①吸取上述新制備的3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-水(55:13:13)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。實驗結果見圖8所示。圖中可以發現氣血舒顆粒供試品與不含遠志的陰性顆粒溶液斑點相同，該薄層鑒別不能將二者鑒別，在遠志對照藥材色譜相應的位置上，有2個斑點相同2個斑點不同，而這不同的2個斑點，在氣血舒顆粒供試品與不含遠志的陰性顆粒溶液中均無，因而遠志對照藥材不能鑒定氣血舒顆粒供試品。

圖8 實驗室條件下制遠志薄層圖(A)Fig.8 Preparation of polygalae thin-layer under laboratory conditions(A)

②吸取上述新制備的供試品溶液2與陰性樣品溶液2各 10 μL，吸取對照品溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-色譜甲醇-水(6:3:0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖9所示。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性樣品溶液2無此斑點。

圖9 實驗室條件下制遠志薄層圖(B)Fig.9 Preparation of polygalae thin-layer under laboratory conditions(B)

2.2 人參皂苷的含量測定

2.2.1 色譜條件

流動相為乙腈(A)-水(B)，采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，梯度洗脫，條件見表1所示。檢測波長：203 nm，柱溫25 ℃，理論板數按人參皂苷Rg1峰計算應不低于6000，如圖10所示。

2.2.2 對照品溶液的制備

(1)對照品溶液1：精密稱取人參皂苷對照品Rg12.57 mg(純度92.4%)、人參皂苷Re對照品2.55 mg(純度93.4%)及人參皂苷Rb1對照品2.87 mg(純度91.2%)，再加甲醇10 mL，搖勻，即得。

(2)對照品溶液2：精密稱取人參皂苷Rg12.78mg(純度92.4%)、人參皂苷Re 2.77 mg(純度93.4%)及人參皂苷Rb1(純度91.2%)3.10 mg，加甲醇制成1 mL含0.257、0.258，0.283 mg的混合溶液。

表1 水提工藝中人參皂苷HPLC測定流動相洗脫條件Table 1 HPLC determination of elution conditions of ginsenoside in extraction process

圖10 氣血舒顆粒中三種人參皂苷的HPLC圖譜Fig.10 HPLC chromatogram of three ginsenosides in Qixueshufu granules

2.2.3 供試品溶液的制備

(1)供試品溶液1：取本品粉末置研缽研細，過四號篩后取20 g，加水150 mL，密塞，超聲處理30 min，濾過，用水飽和正丁醇溶液萃取2次，合并水飽和正丁溶液，將萃取液旋轉蒸發至干，殘渣加甲醇5 mL溶解，蒸干甲醇，再加甲醇2 mL溶解，濾過，取續濾液，即得。

(2)供試品溶液2：按處方比稱取11味藥材共115 g，煎煮時保持微沸，加10倍量水，浸泡0.5 h后，煎煮30 min，濾過，第二次加8倍量水，煎煮30 min，濾過，將提取液濃縮至100 mL，100 mL正丁醇萃取三次，取正丁醇層蒸干，加甲醇轉移至10 mL容量瓶，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備

(1)陰性樣品溶液1(未制顆粒)：按處方量比例稱取不含人參的其它10味藥材共105 g，煎煮時保持微沸，加10倍量水，浸泡0.5 h后，煎煮30 min，濾過，第二次加8倍量水，煎煮30 min，濾過，將提取液濃縮至100 mL，100mL 正丁醇萃取三次，取正丁醇層蒸干，加甲醇轉移至10毫升容量瓶，即得。

(2)陰性樣品溶液2：按照處方比例取不含人參的其他 10味藥材，按照已確定的氣血舒顆粒的制備工藝制備出不含人參的陰性樣品。稱取6.8 g不含人參的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.5 樣品測定

采用雙標雙樣法測定，分別用對照品溶液1與對照品溶液2色譜峰計算含量，取其平均值作為該實驗處理樣品的含量。

2.2.6 顆粒樣品測定

取三批氣血舒顆粒制備供試品溶液，進樣，結果見表2所示。

式中：As為供試品的峰面積；Ar為對照品的峰面積；Vr為對照品的進樣量,μL；Vs為樣品的進樣量,μL；Ws為樣品的稱樣量,g；Cr為對照品的濃度,mg/mL；G為水分含量；V為樣品的稀釋倍數。

人參皂苷Rgl與Re總含量為0.372～0.388 mg/g，平均值為0.380 mg/g，人參皂苷Rb1含量為0.311～0.323 mg/g，平均值為0.316 mg/g。

表2 氣血舒顆粒人參皂苷含量Table 2 Contents of ginsenosides in Qixueshu granules

2.2.7 人參飲片的測定

取人參飲片，照藥典方法制備供試品溶液，過0.22 μm微孔濾膜后，精密吸取10 μL進樣，測定人參皂苷Rgl、Re與Rbl含量，測定結果見表3，結果達到2020版《中國藥典》標準。

表3 人參中人參皂苷含量Table 3 The content of ginsenoside in ginseng

2.2.8 人參皂苷轉移率的計算

可由下式計算人參皂苷轉移率：

結果見表4、表5所示。

表4 氣血舒顆粒中人參皂苷Rg1與Re總量轉移率Table 4 Total transfer rate of ginsenoside Rg1 and Re in Qixueshufu Granules

表5 氣血舒顆粒中人參皂苷Rb1轉移率Table 5 Transfusion rate of ginsenoside RB1 in Qixueshufu Granules

2.2.9 氣血舒顆粒中人參皂苷限量規定

氣血舒顆粒制劑處方11味(其中人參167 g)，制備成1000 g顆粒，每袋裝30 g。

氣血舒顆粒三批驗證人參皂苷Rg1+Re總含量轉移率均值為50.2%，轉移率按40%計；結合2020版《中國藥典》人參中人參皂苷Rgl+Re總量不得少于0.30%，計算每袋氣血舒顆粒人參皂苷Rg1+Re總含量不得少于6.0 mg。

氣血舒顆粒三批驗證人參皂苷Rb1含量轉移率均值為86.2%，轉移率按75%計；結合2020版《中國藥典》人參中人參皂苷Rb1含量量不得少于0.20%，計算每袋氣血舒顆粒人參皂苷Rb1含量不得少于7.5 mg。

3 討 論

3.1 TLC法鑒別

在對氣血舒顆粒專屬性進行考察時，我們發現白術、當歸、川穹分離度差，茯苓與茯神專屬性差， 其余幾味藥材的專屬性強，分離度好，可以作為氣血舒顆粒的質量標準。

3.2 色譜條件的優化

本實驗首先通過中國藥典中分離人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1條件上，取供試品溶液2進行條件考察，結果發現該條件不能很好分離三種物質。因此在此基礎上，優化了洗脫條件，見表3所示，結果各峰型分離良好。

3.3 供試品溶液制備方法考察

本實驗采取四種方法制備供試品溶液，按照優化后的色譜條件進樣，結果發現按藥典方法提取的S1溶液沒有目標峰。S3是用水飽和正丁醇直接提取，其目標峰能夠提出，但各目標峰峰面積小于供試品溶液1，且S3所用顆粒為50 g，水飽和正丁醇超聲提取后，甲醇2 mL溶解后測定，而供試品溶液1所用顆粒為20 g，水溶后，再用水飽和正丁醇萃取，再用甲醇 2 mL溶解后測定，因而供試品溶1制備方法更適合于本顆粒劑人參皂苷Rg1、Re與Rb1的測定，故人參皂苷質量標準的制定應選擇試品溶液1制備方法。

3.4 陰性樣品溶液考察

取陰性樣品溶液1、對照品溶液、供試品溶液2，按優化后的色譜條件分別進樣，我們發現與對照品溶液相比較，按處方量制備的供試品溶液3中人參皂苷Rg1、Re與Rb1色譜峰明顯，陰性樣品溶液1在人參皂苷Rg1、Re與Rb1相應位置上無相應峰，因而按處方所制陰性清膏無干擾，制備方法可行。

4 結 論

氣血舒顆粒是用于治療腫瘤的經典方劑，選擇合理的簡便的質量評價方法能夠有效控制和保證其質量，以保證制劑用藥安全[16-17]。從全過程進行質量控制，即從藥材基原、炮制、生產工藝、質量標準等方面來控制苦杏仁及其制劑質量，科學制定相應的質量標準、含量范圍、安全劑量，為指導臨床用藥安全劑量提供科學依據，也將對含有人參皂苷的中藥制劑質量標準的全面提高有重要意義。

本文通過薄層色譜(TLC)法對氣血舒顆粒中除人參外其余物質進行定性鑒別，斑點與對照品相比一致。氣血舒顆粒中以人參為君藥，因此通過高效液相色譜法(HPLC)分離人參皂苷Rg1、Rb1、Re以及含量測定，以此為氣血舒顆粒提供用藥質量標準的參考。