取卵與ICSI注射時間間隔對ICSI周期臨床結局的影響

宏蘋蘋，李濤，歐建平

(中山大學附屬第三醫院生殖醫學中心，廣州 510630)

卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)是一種用于治療不孕特別是嚴重男性因素所致不孕的輔助生殖技術，其過程是利用顯微操作技術將單個精子注射到卵母細胞的細胞漿中，使其受精，培養成胚胎，再植入女方宮腔內，從而達到妊娠目的。卵母細胞質量是受精和胚胎發育的重要因素之一[1-2]。卵母細胞在受精前暴露于體內和體外環境的時間對于獲得高質量的卵母細胞和胚胎可能具有至關重要的意義。Rienzi等[3]研究了卵母細胞不同預孵育期與ICSI結果之間的關系，發現ICSI前至少3 h的預孵育期可以提高胚胎質量。其他研究表明，在ICSI前進行卵母細胞預孵育與卵母細胞成熟、受精和胚胎質量的提高有關[4-5]。但也有研究認為，在顆粒細胞剝離之前延長卵母細胞孵育時間對受精或ICSI結局沒有影響[6-9]。

有研究結果顯示，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)后36 h取卵，可以促進卵母細胞成熟，從而改善胚胎和妊娠結局，是影響ICSI妊娠率最為重要的因素[10-11]。如果HCG作用時間不夠，即使推遲剝離顆粒細胞及注射精子，也無法彌補卵母細胞在卵泡微環境中暴露時間不足的缺陷。迄今為止，取卵后到ICSI注射的最適時間仍有爭議。黃國寧等[12]指出ICSI注射應安排在取卵后2～4 h進行，而Dozortsev等[13]的研究得出ICSI注射的最佳時間是HCG后37～41 h的結論。Kilani等[14]發現，多數MⅡ期卵母細胞在HCG后39～40.5 h可以觀察到紡錘體且有最高的阻滯值，因此HCG后39～40.5 h可能是ICSI的最佳時間。

基于輔助生殖胚胎實驗室的日常工作安排，本中心的ICSI注射一般為取卵后4 h以上，特殊情況可提前至取卵后2～4 h，但臨床上關于不同的取卵與ICSI注射時間間隔(OPU-ICSI時間間隔)是否會影響ICSI周期結局還有爭議。因此，本研究旨在探討本中心不同OPU-ICSI時間間隔行ICSI的周期結局，以期更好地優化周期管理和工作流程。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2015年9月至2020年5月在中山大學附屬第三醫院生殖醫學中心因男性因素不孕而接受ICSI周期治療患者的臨床資料。排除標準：(1)無精子癥患者及冷凍精液周期；(2)未獲卵周期；(3)無可利用胚胎周期；(4)未移植周期。

本研究共納入1 205例患者的1 205個新鮮移植或凍融胚胎移植(FET)周期。根據OPU-ICSI時間間隔不同，將患者分為A組(間隔2～4 h，362例)和B組(間隔>4 h，843例)。

二、研究方法

1.促排卵方案：主要采用黃體期長方案或拮抗劑方案。以超聲檢查、血尿黃體生成素(LH)峰值測定等方法綜合監測卵泡的生長發育。并根據卵巢反應調整促性腺激素(Gn)的劑量，當超聲下觀察到雙側卵巢至少有1個卵泡直徑達18 mm時，肌肉注射HCG 6 000～10 000 U，36 h后在陰道超聲引導下取卵。

2.體外授精：獲得的卵母細胞沖洗干凈后，置于含10%人血清白蛋白(HSA)的G-IVF(Vitrolife，瑞典)培養液中，覆蓋礦物油(Vitrolife，瑞典)，放置于37℃、6%CO2、5%O2和89%N2環境的三氣培養箱(COOK，美國)中培養，直至去除顆粒細胞。根據實驗室工作安排，在取卵后一定時間將卵母細胞置于透明質酸酶(SAGE，丹麥)中消化去除顆粒細胞后進行ICSI注射。注射后將卵母細胞洗凈，置于含5%HSA的G-1(Vitrolife，瑞典)培養液中培養。精液處理采用密度梯度離心法。

3.胚胎培養：ICSI注射后16～18 h觀察受精情況，評估胚胎的正常受精率(2PN受精率)、異常受精率和ICSI退化率(ICSI卵母細胞退化指卵母細胞在ICSI注射后或者第2天觀察受精時發生凋亡；ICSI退化率=ICSI退化卵母細胞數/注射MⅡ卵總數×100%)。將正常受精的胚胎置于含5%HSA的G-1微滴中培養至第3天，根據胚胎卵裂球數目、卵裂球均一性及碎片程度對胚胎質量進行評估。經患者知情同意后選擇移植或冷凍或者在含5%HSA的G-2(Vitrolife，瑞典)培養液中繼續培養至囊胚。囊胚質量評估采用Gardner評分法[15]。

4.胚胎冷凍和解凍：胚胎冷凍使用開放式玻璃化冷凍系統(Kitazato，日本)；解凍使用玻璃化解凍試劑盒(Kitazato，日本)，解凍后胚胎放置于含5%HSA的G-2培養液中培養2 h后再移植。

5.胚胎移植和妊娠判斷：本研究納入患者的首次移植資料，即取卵周期的首次新鮮移植或者取卵周期全胚冷凍后的首次FET。選擇評分最高的1～2枚卵裂期胚胎或囊胚在超聲引導下進行胚胎移植。臨床妊娠定義為胚胎移植后6～7周經超聲檢查出現至少1個孕囊(包括異位妊娠)及胎心搏動。

三、統計學分析

結 果

一、患者基本情況

本研究共納入1 205例患者，其中A組362例，B組843例。兩組患者的平均年齡、體質量指數(BMI)、Gn用量、扳機日E2水平、注射HCG與取卵時間間隔(HCG-OPU時間間隔)及不同卵巢刺激方案占比均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者的實驗室指標和臨床結局比較

兩組患者的各項實驗室指標如獲卵數、卵子成熟率、受精率、2PN受精率、異常受精率、ICSI退化率、優胚率、移植胚胎類型、平均移植胚胎數等差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。兩組間的臨床妊娠率、流產率、活產率、新生兒平均出生孕周及出生體重均無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者的實驗室指標比較[(-±s)，M(P25，P75)，n(%)]

表3 兩組患者的臨床結局比較[(-±s)， n(%)]

三、Pearson相關性分析結果

OPU-ICSI時間間隔與主要實驗室指標的相關性分析顯示，OPU-ICSI時間間隔與卵子成熟率(P=0.099)、2PN受精率(P=0.497)和優胚率(P=0.910)均無顯著相關性(表4)。

四、二元Logistic回歸分析結果

將可能影響臨床妊娠率的各種因素，包括女方年齡、扳機日E2水平及OPU-ICSI時間間隔等納入Logistic回歸分析，調整混雜因素后發現，在1 205例患者中，女方年齡、獲卵總數、2PN受精率、優胚率能顯著影響臨床妊娠率(P<0.05)，而OPU-ICSI時間間隔、HCG-OPU時間間隔等因素并不顯著影響臨床妊娠率(P>0.05)(表5)。

表5 臨床妊娠率影響因素的二元Logistic回歸分析

討 論

獲得高質量的成熟卵母細胞是輔助生殖治療中的關鍵因素之一。在卵泡生長的最后階段存在一個復雜的動態過程，包括結構、分子和生化修飾，稱為卵母細胞成熟。在此過程中，卵母細胞周圍顆粒細胞的連接蛋白和縫隙連接的表達與卵母細胞在短時間內成熟有關[16-18]。HCG-OPU時間間隔是卵母細胞體內成熟的關鍵[19]。研究證實，適當延長體內成熟時間，即HCG-OPU時間間隔>36 h，有助于促進卵母細胞的成熟，從而改善胚胎質量和妊娠結局[10-11]。在本研究中，按照OPU-ICSI時間間隔不同分為間隔2～4 h組(A組)和>4 h組(B組)，兩組的HCG-OPU時間間隔均>36 h，B組的卵子成熟率略高于A組，但兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

有研究表明，在ICSI周期中，卵母細胞取出到ICSI注射之間的預孵育期可提高卵母細胞成熟率、受精率和胚胎質量[3-5，13，20]。因為卵母細胞在ICSI注射前的孵育可誘導胞漿成熟，使卵母細胞獲得充分激活，從而提高受精率和妊娠率。在本研究中，B組的卵子成熟率和受精率略大于A組，2PN受精率和優胚率略低于A組，但差異均無統計學意義(P>0.05)。Pearson相關性分析結果也表明，OPU-ICSI時間間隔與卵子成熟率、2PN受精率及優胚率無顯著性相關(P>0.05)。還有研究表明，受精率提高的原因不僅與細胞質的進一步成熟有關，還與卵母細胞的老化有關[9，21]。第二次減數分裂有兩個重要的調節因子：M期啟動子(MPF)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，二者隨著卵母細胞的老化活性降低，從而導致卵母細胞的自發激活[22-23]。因此，MPF水平較低的老化卵母細胞更有可能被ICSI激活形成原核，從而解釋了受精率隨著OPU-ICSI時間間隔延長而增加的原因，但老化的卵母細胞中，異常受精也可能增加[24]。另外，一些研究發現，顆粒細胞剝除前孵育2～4 h可以提高優質胚胎率[5，25]；但孵育時間越長，優質胚胎率就越低[23]。潛在的原因可能是因為顆粒細胞能促進卵母細胞胞質的進一步成熟，有利于隨后的胚胎發育[26-27]。

Pujol等[9]的一項回顧性試驗提出，OPU-ICSI時間間隔每增加1 h，臨床妊娠率下降7.7%。也有研究發現，卵母細胞在ICSI注射前孵育4或6 h的妊娠率相似或增加，但超過6 h后妊娠率顯著下降[22，28]。這可能是由于卵母細胞在剝除顆粒細胞前孵育一段時間達到了受精的最佳狀態，但過度孵育會導致超微結構和基因表達的改變，增加紡錘體異常的發生率，從而影響胚胎的發育潛能[29-30]。但也有研究表明，OPU-ICSI時間間隔不影響ICSI的受精和妊娠結局[6-9]。Garor等[6]的研究發現，延遲卵母細胞剝離或ICSI注射并沒有增加受精或妊娠率，本研究結果與之相似。本研究中兩組間的臨床妊娠率、流產率、活產率及新生兒出生結局均無顯著性差異(P>0.05)，并且對影響臨床妊娠率的因素進行了回歸分析，校正混雜因素后發現女方年齡、獲卵總數、2PN受精率和優胚率能顯著影響臨床妊娠率(P<0.05)，而OPU-ICSI時間間隔等與臨床妊娠率沒有顯著關聯(P>0.05)。如今ICSI的最佳注射時間仍無定論，本中心在參考國內外共識、相關論著及自身工作安排等基礎上，將ICSI注射時間定為取卵后大于4 h，特殊情況如法定節假日等為了不延長工作時間可調整在取卵后2～4 h行ICSI注射。本研究的結果顯示，不同的OPU-ICSI時間間隔并不會對患者的妊娠結局造成明顯的負面影響，這有助于胚胎實驗室工作人員有效地安排工作，提高實驗室工作效率。

綜上，OPU-ICSI時間間隔與臨床妊娠率沒有顯著關聯，在不影響ICSI周期妊娠結局的情況下，靈活地安排ICSI時間，可以優化周期管理和工作流程，以適應輔助生殖治療日益增長的需求。