HECTD1激活mTOR信號促進心肌細胞肥大的機制研究

焦薇 郭娜 祖秀光 郝杰 孟明杰 謝亞囡 高偉年

病理型心肌肥厚具有不可逆性，持續的肥厚最終導致心力衰竭。因此，靶向心肌肥厚是治療心力衰竭的有效途徑之一[1]。含與E6-AP羧基末端同源結構域的E3泛素化蛋白連接酶1(HECT Domain E3 Ubiquitin Protein Ligase 1，HECTD1)在調控細胞發育等方面起著非常重要的作用，但在其是否在心肌肥厚中也發揮重要作用有待確定。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin,mTOR)是一種進化保守激酶，調節一系列與新陳代謝和生長有關的細胞過程[2,3]。既往研究顯示mTOR可以調節心臟生長以應對壓力過載，并通過調節免疫細胞參與心肌肥厚，改變炎性反應和心臟肥大[4]。本研究主要探討HECTD1 是否調節mTOR信號通路參與心肌細胞肥大的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ)購自Millipore公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記二抗購自中杉金橋。微滲透壓泵(Osmotic pumps)購自美國ALZET公司。HECTD1抗體、磷酸化mTOR(p-mTOR)抗體、核糖體蛋白S6激酶B1(ribosomal protein S6 kinase B1，S6K)抗體、mTOR抗體和磷酸化S6K (pS6K) 抗體購自Cell Signaling Technology。電致化學發光液購自Millipore公司。本實驗所有的細胞培養基購自 Gibco。胎牛血清購自Gibco。抗生素購自Gibco。RNA逆轉錄試劑盒購自賽默飛；RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司。qRT-PCR引物由北京天一輝遠生物技術有限公司合成。本研究中涉及到的心肌肥厚患者病理組織及對照樣本收集于本科室，并通過了河北醫科大學倫理委員會審批。本實驗所采用的SPF級SD成年大鼠購自北京維通利華生物科技有限公司，所有大鼠均為雄性，平均體重為290 g。SFP級SD新生大鼠16只，出生時間為72 h，每組8只，雌雄不限，購自北京維通利華生物科技有限公司。

1.2 大鼠心肌肥厚模型構建 本實驗所有操作內容及步驟均按照規定章程進行。項目經過河北醫科大學倫理委員會審核通過。將SD大鼠(動物合格證號：110332220100014068) 使用氣體麻醉，之后在SD大鼠背部皮下植入含有血管緊張素Ⅱ的緩釋泵，緩釋劑量為1.5 mg·kg-1·d-1，實驗周期為4周。實驗過程中通過心肌肥厚標志基因表達檢測心肌肥厚模型構建是否成功。

1.3 大鼠原代心肌細胞分選與培養 取1～3 d日齡SD大鼠心室組織(合格證號：110322210103029728)，預冷PBS沖掉多余的血液，將剪碎至乳糜狀，37℃胰酶消化至單細胞懸液，終止消化后用40 μm濾網過濾細胞，1 500 r/min離心后棄上清，將心肌細胞重懸后置于培養皿中，在37℃培養箱預貼壁2 h去除非心肌細胞，隨后輕輕將上層未貼壁的心肌細胞轉移至其他培養皿培養待用。

1.4 siRNA介導基因沉默 利用RNAiMAX試劑盒將預先合成的siRNA轉染進入心肌細胞。SiRNA靶點序列為5’-GAGTAACCAGGTGTCAACAATTGTA-3’。取20 nmol/L siRNA加入200 μl轉染用培養基中，室溫靜置15 min；取4 μl RNAiMAX加入200 μl轉染用培養基中，室溫靜置15 min。將兩者混合之后室溫靜置15 min后加入細胞培養皿中，干擾HECTD1的表達。

1.5 心肌細胞肥大模型 分離的原代心肌細胞靜置培養48 h后，進行血清剝奪培養24 h，隨后用血管緊張素Ⅱ(1 μmol/L)刺激48 h誘導心肌細胞肥大。

1.6 Western blot 將待測樣本使用蛋白裂解液混勻后進行裂解。樣本置于冰上30 min后，于4℃，12 000 r/min離心。取上清棄去沉淀。測定蛋白濃度之后，準備30 μg蛋白進行電泳。電泳完畢后進行轉膜，之后進行5%脫脂牛奶封閉抗原后進行一抗孵育，孵育條件為4℃過夜。第2天將PDVF膜用洗膜緩沖液(tris buffered saline twee，TBST)緩沖液洗干凈后孵育對應二抗，孵育條件為室溫 2 h。最后用ECL發光液進行顯影分析蛋白表達水平。

1.7 qRT-PCR 使用細胞裂解液裂解組織或者細胞，提取總RNA，并對RNA進行定量。使用qPCR方法對基因進行定量檢測。見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 ANP、BNP、MYH7和HECTD1在心肌肥厚患者中的表達比較 在心肌肥厚組中肥厚標志基因ANP、BNP和MYH7均顯著增加(P<0.05)。與對照組比較，HECTD1表達水平在心肌肥厚組中顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 ANP、BNP、MYH7和HECTD1基因表達比較

2.2 HECTD1在心肌肥厚大鼠中的表達 血管緊張素Ⅱ處理可以顯著增加心肌肥厚標志基因(ANP、BNP和MYH7)的表達，說明心肌肥厚模型構建成功。與對照組(1.00±0.13)比較，HECTD1的mRNA表達水平在大鼠Ang Ⅱ組(3.14±0.89)中顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 ANP、BNP、MYH7和HECTD1表達水平比較

2.3 SiRNA介導沉默 HECTD1 Western blot 結果顯示，與si-NC 組比較，si-HECTD1組條帶明顯減弱；定量分析結果表明，HECTD1干擾組(0.19±0.02)的表達水平顯著低于干擾對照組(1.00±0.11)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表4。

圖1 siRNA可以有效地降低HECTD1的蛋白水平

表4 HECTD1相對表達量

2.4 HECTD1沉默抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大 PBS Si-NC組心肌細胞面積與Ang Ⅱ Si-NC組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。AngⅡ Si-HECTD1組心肌細胞面積與Ang Ⅱ Si-NC組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。AngⅡ Si-NC組誘導了心肌肥厚標志基因ANP、BNP和MYH7的表達，使其升高為(3.21±0.31)、(3.82±0.30)和(4.11±0.30)，差異均有統計學意義(P<0.01)。敲低HECTD1的表達后，心肌細胞中ANP、BNP和MYH7的表達水平分別降低為(1.54±0.19)、(1.64±0.11)和(1.90±0.11)，與Ang Ⅱ Si-NC組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表5。

表5 干擾HECTD1有效抑制心肌肥大

2.5 HECTD1沉默抑制血管緊張素Ⅱ誘導的mTOR信號的激活 Western blot結果顯示，Si-NC組與PBS 處理比較，采用血管緊張素Ⅱ處理升高了心肌細胞中p-mTOR和p-S6K的蛋白表達水平，表明血管緊張素Ⅱ可以顯著激活mTOR-S6K信號通路，當HECTD1被敲低以后(Si-HECTD1組)，心肌細胞中p-mTOR和p-S6K的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 沉默HECTD1表達抑制血管緊張素Ⅱ對mTOR通路活性

3 討論

心血管疾病已經成為危險人類健康的最主要的風險因素。每年超過30%的死亡與心血管疾病相關[5]。

心肌肥厚是多種心血管疾病共有的發病基礎[6]，但筆者查閱后發現心肌肥厚的發病機制尚不清楚。本研究中我們發現E3蛋白泛素連接酶HECTD1促進心肌細胞肥大。在患者和大鼠肥厚心肌組織中，HECTD1的表達均呈現顯著增加的表達特征。我們在大鼠原代心肌細胞中發現HECTD1可以促進心肌細胞肥大。分子機制的研究發現HECTD1可以抑制mTOR-S6K信號的激活。

蛋白泛素化修飾在心血管疾病中起著重要的調節作用[7]。HECTD1是一種E3蛋白泛素連接酶，其參與到細胞分化等生物學過程，并在神經發育過程中起著非常重要的角色。HECTD1調控細胞內Hsp90的定位和分泌，以控制顱間質細胞行為[8]。在胎盤的交界區內的多種類型的細胞發育和分化過程中，HECTD1同樣起著非常關鍵的作用[9]。此外，HECTD1通過調節蛋白泛素化修飾參與環狀NA在硒誘導的巨噬細胞活化過程中的功能[10]。HECTD1 促進APC-Axin相互作用，從而負向調控Wnt信號[11]。HECTD1也可以通過泛素化調控IQGAP1蛋白水平，從而介導包括Paxillin和Actinin招募在內的FXs的動力學過程[12]。但是，我們發現HECTD1在心血管疾病中的功能尚不清楚。為了研究HECTD1在心肌肥厚中的潛在功能和分子生物學機制，我們首先在患者肥厚的心肌組織中研究了HECTD1的表達，結果顯示HECTD1在患者肥厚心肌組織中呈現高表達。同時，本研究也在大鼠中利用血管緊張素Ⅱ誘導了大鼠心肌肥厚，結果顯示在我們構建的大鼠心肌肥厚模型中，HECTD1的表達水平也明顯增加。這些結果都提示HECTD1在心肌肥厚中可能起著重要的調節作用。

為了進一步研究HECTD1在心肌細胞肥大中的功能，進一步分離培養了大鼠原代心肌細胞并構建了大鼠心肌細胞肥大的模型，即血管緊張素Ⅱ誘導大鼠心肌細胞肥大。我們利用siRNA在原代大鼠心肌細胞中敲低了HECTD1的表達。結果顯示沉默HECTD1表達可以顯著地抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞面積的增大。同時，沉默HECTD1表達可以顯著地抑制血管緊張素Ⅱ對心肌肥厚相關基因表達的激活作用。上述這些結果表明HECTD1促進血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大。

心肌細胞的肥大過程受到多種胞外和胞內信號的調控作用[13,14]。進一步，本研究探討了HECTD1促進血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大的具體分子機制。心肌細胞的肥大受到多種胞外和胞內的信號的調節作用[6]。mTOR信號是促進心肌細胞肥大的關鍵信號分子之一。mTOR通過激活下游S6K信號控制細胞中蛋白質的合成，進而促進心肌細胞的肥大過程[13]。研究表明，利用雷帕霉素抑制mTOR的活性可以抑制心肌細胞肥大并阻止心力衰竭的發生和發展[4]。而mTOR在心肌肥厚過程中如何被調控并不完全清楚[15]。在我們的心肌細胞肥大模型中，我們也觀察到mTOR-S6K信號被血管緊張素Ⅱ激活。此外，我們也發現沉默HECTD1可以顯著地抑制血管緊張素Ⅱ對mTOR-S6K的激活作用。這些結果提示HECTD1在心肌肥厚中調節mTOR信號活性，并且HECTD1對mTOR的調控作用是其參與心肌細胞肥大非常重要的分子基礎之一。

綜上所述，本研究發現HECTD1在心肌肥厚過程中高表達，HECTD1的高表達可以通過激活mTOR信號促進心肌細胞肥大的發生和發展。因此，HECTD1可能成為潛在治療心肌肥厚的分子靶點。