沉默FOXD3-AS1調控miR-335-3p/PTEN對H2O2作用的神經細胞損傷的影響

劉秀竹 劉鴻淵 李宗平 廖英 王曉毅

氧化應激誘導的神經細胞損傷是神經退行性疾病的重要發病機制，影響神經退行性疾病的進展[1,2]。因此，抑制神經細胞氧化應激損傷對治療相關疾病具有重要意義。研究表明lncRNA在神經系統及神經系統疾病中具有重要作用[3]。叉頭框轉錄因子D3反義RNA 1(forkhead box D3 antisense RNA 1,FOXD3-AS1)是一種lncRNA，研究報道氧葡萄糖剝奪/復氧后N2a細胞中FOXD3-AS1上調，FOXD3-AS1敲低可通過miR-765/BCL2L13軸防止腦缺血/再灌注損傷[4]。FOXD3-AS1過表達可通過促進自噬加重心肌細胞的缺血/再灌注損傷[5]。然而FOXD3-AS1對過氧化氫(H2O2)作用的神經細胞損傷的影響及機制尚不清楚。miR-335-3p是一種富含神經元的microRNA，與神經系統疾病有關；研究報道敲除circTLK1通過miR-335-3p/TIPARP可以顯著減少梗死體積，減輕神經元損傷并改善神經功能缺損[6]。H2O2誘導的HLE-B3細胞氧化應激模型中miR-335-3p下調表達[7]。但miR-335-3p在H2O2作用的神經細胞中的表達及作用尚不清楚。研究表明，10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)在神經保護和神經元再生中起重要作用，抑制PTEN表達有益于周圍神經損傷后的神經再生和功能恢復[8]。甘氨酸通過PTEN/Akt信號通路減輕大鼠腦出血損傷[9]。生物學軟件預測發現FOXD3-AS1與miR-335-3p有結合位點，miR-335-3p與PTEN有結合位點，但其之間的關系尚不清楚。本實驗旨在研究FOXD3-AS1對H2O2作用的神經細胞損傷的影響及機制是否與miR-335-3p和PTEN相關。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞(美國ATCC)；DMEM培養基(美國GIBCO)；H2O2(上海鈺博生物)；Trizol試劑(南京森貝伽生物)；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(武漢科昊佳生物)；RIPA蛋白裂解液(上海北諾生物)；MTT試劑盒(大連美侖生物)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物)；CAT、SOD活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒(上海研卉生物)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海翌圣生物)。

1.2 細胞處理與分組 PC12細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，用200 μmol/L的H2O2處理細胞24 h，記為H2O2組；常規培養不作處理的細胞作為Control組；將FOXD3-AS1干擾載體及其陰性對照、miR-335-3p模擬物及其陰性對照轉染至PC12細胞后用200 μmol/L的H2O2處理，記為H2O2+si-FOXD3-AS1組、H2O2+si-NC組、H2O2+miR-335-3p組、H2O2+miR-NC組；將FOXD3-AS1干擾載體與miR-335-3p抑制劑共轉染至PC12細胞后用200 μmol/L的H2O2處理，記為H2O2+si-FOXD3-AS1+anti-miR-335-3p組。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測FOXD3-AS1和miR-335-3p的表達水平 提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，以GAPDH和U6為內參進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。FOXD3-AS1上游引物序列：5’-GGTGGAGGAGGCGAGGATG-3’，下游引物序列：5’-AGCGGACAGACAGGGATTGG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CTGACATGCCGCCTGGAGA-3’，下游引物序列：5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’；miR-335-3p上游引物序列：5’-GTTTTTCATTATTGCTCCTGACCA-3’，下游引物序列：5’-CGTGCATCTAGACCGTCATAG

A-3’；U6上游引物序列：5’-ATGACGTCTGCCTTGGAG

AAC-3’，下游引物序列：5’-TCAGTGTGCTACGGAGTT

CAG-3’。

1.4 蛋白質印跡法檢測PTEN蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，定量后進行SDS-PAGE電泳，每孔泳道上樣40 μg蛋白，電泳結束后將蛋白轉至PVDF，將膜置于5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入PTEN一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，顯影、定影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為參照計算PTEN相對表達水平。

1.5 MTT檢測細胞活力 4組細胞48 h每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后棄去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩反應10 min，用酶標儀檢測490 nm吸光度(OD)值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，漂洗后加入結合緩沖液重懸，然后加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻，避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 試劑盒檢測細胞中CAT、SOD的活性以及MDA的含量 收集各組培養48 h的細胞，按試劑盒說明書進行操作。

1.8 雙熒光素酶報告實驗 將FOXD3-AS1及PTEN的野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC、miR-335-3p共轉染至PC12細胞中，然后按照試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的神經細胞氧化應激的影響 與Control組比較，H2O2組CAT、SOD活性降低，MDA含量升高(P<0.05)；與H2O2組和H2O2+si-NC組比較，H2O2+si-FOXD3-AS1組CAT、SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。見表1。

表1 沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的PC12氧化應激的影響

2.2 沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的神經細胞凋亡的影響 與Control組比較，H2O2組FOXD3-AS1及PTEN表達水平升高，miR-335-3p表達水平降低，細胞活力降低，細胞凋亡率升高(P<0.05)；與H2O2組和H2O2+si-NC組比較，H2O2+si-FOXD3-AS1組FOXD3-AS1及PTEN表達水平降低，miR-335-3p表達水平升高，細胞活力升高，細胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的PC12凋亡及PTEN蛋白表達的影響;A 沉默FOXD3-AS1可抑制H2O2誘導PC12細胞中PTEN蛋白的表達;B 沉默FOXD3-AS1可抑制H2O2誘導PC12細胞凋亡

表2 沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的PC12凋亡的影響

2.3 miR-335-3p對H2O2處理的神經細胞凋亡氧化應激的影響 與H2O2組和H2O2+iR-NC組比較，H2O2+miR-335-3p組miR-335-3p表達水平升高，PTEN表達水平降低，細胞活力升高，細胞凋亡率降低，CAT、SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 miR-335-3p對H2O2處理的PC12凋亡及PTEN蛋白表達的影響；A miR-335-3p可抑制H2O2誘導PC12細胞中PTEN蛋白的表達；B miR-335-3p可抑制H2O2誘導PC12細胞凋亡

表3 miR-335-3p對H2O2處理的PC12凋亡氧化應激的影響

2.4 FOXD3-AS1靶向miR-335-3p、miR-335-3p靶向PTEN DIANA Tools軟件預測顯示FOXD3-AS1和miR-335-3p有互補序列；targetscan軟件預測顯示miR-335-3p和PTEN有互補序列。wt-FOXD3-AS1或wt-PTEN與miR-335-3p共轉染的細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；而mut-FOXD3-AS1或mut-PTEN與miR-335-3p共轉染的細胞熒光素酶活性無顯著變化。見表4，圖3。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖3 FOXD3-AS1、miR-335-3p、PTEN的靶向關系預測;A FOXD3-AS1和miR-335-3p的互補序列;B miR-335-3p和PTEN的互補序列

2.5 抑制miR-335-3p可逆轉沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的神經細胞凋亡氧化應激的影響 與H2O2+si-FOXD3-AS1組比較，H2O2+si-FOXD3-AS1+anti-miR-335-3p組miR-335-3p表達水平降低，PTEN表達水平升高，細胞活力降低，細胞凋亡率升高，CAT、SOD活性降低，MDA含量升高(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 抑制miR-335-3p可逆轉沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的PC12凋亡的作用;A 抑制miR-335-3p可逆轉沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的PC12中PTEN蛋白表達的抑制作用;B 抑制miR-335-3p可逆轉沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的PC12凋亡的抑制作用

表5 抑制miR-335-3p可逆轉沉默FOXD3-AS1對H2O2處理的PC12凋亡氧化應激的作用

3 討論

神經退行性疾病是嚴重影響人類健康的常見疾病，氧化應激在其中發揮重要作用，過量自由基可導致機體氧化應激水平升高，從而引起神經元的損傷和凋亡[10,11]。H2O2廣泛用于細胞氧化應激模型的制作。本實驗用H2O2處理PC12細胞誘導氧化損傷模型。研究報道FOXD3-AS1敲低可通過上調miR-150-5p延長細胞存活率并抑制細胞凋亡，從而保護AC16心肌細胞免受缺氧誘導的損傷[12]。FOXD3-AS1通過海綿化miR-150調節氧化應激誘導的肺上皮細胞凋亡[13]。本實驗結果顯示，H2O2作用的神經細胞中FOXD3-AS1表達水平升高。沉默FOXD3-AS1后，細胞活力升高，細胞凋亡率降低，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，丙二醛(MDA)含量降低；CAT、SOD是關鍵的抗氧化酶，CAT可通過破壞細胞中的H2O2產生水和氧氣來在很大程度上減輕氧化應激[14]。SOD具有清除氧自由基的作用，可增強細胞的抗氧化能力；MDA是脂質過氧化代謝的終產物，其含量直接反映體內脂質過氧化的速率和強度[15]。因此，本實驗結果表明沉默FOXD3-AS1可減弱H2O2處理PC12細胞凋亡及氧化應激。

研究報道miR-19b可通過靶向PTEN，抑制氧化應激，促進細胞存活和抑制細胞凋亡，從而發揮神經元保護作用[16]。沉默PTEN可以抑制七氟醚引起的氧化應激損傷和海馬細胞凋亡[17]。本實驗結果顯示，H2O2作用的神經細胞中PTEN表達水平升高，說明PTEN可能與神經細胞損傷有關，與前人研究結果相符。且本實驗發現miR-335-3p靶向調控PTEN。H2O2作用的神經細胞中miR-335-3p表達降低；過表達miR-335-3p，細胞活力升高，凋亡率降低，CAT、SOD活性升高，MDA含量降低；說明過表達miR-335-3p可減弱H2O2處理PC12細胞凋亡及氧化應激，其機制可能與調控PTEN有關。此外，本實驗還發現，FOXD3-AS1可有效靶向調控miR-335-3p；而抑制miR-335-3p可逆轉沉默FOXD3-AS1，對H2O2處理的PC12細胞損傷的作用。

綜上所述，沉默FOXD3-AS1通過調控miR-335-3p/PTEN軸減輕H2O2作用的神經細胞損傷。