上調miR-155-5p對脊柱結核病模型小鼠的干預作用

吳術其

脊柱結核的發病率占全身骨關節結核的首位，其中又以椎體結核占大多數,脊柱結核主要源自于肺結核，臨床常見的表現有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等肺結核癥狀，長期患有脊柱結核的患者會引起脊柱椎體的骨破壞[1-3]。MicroRNAs (miRNAs)是小型、高度保守的RNA分子，通過堿基配對調節其同源mRNA的分子表達在個體的發育、細胞增殖、分化和細胞周期中均發揮重要作用。miR-155-5p可對泡沫細胞動脈粥樣硬化的減慢具有預測作用，同時已有數據顯示可作為鱗狀上皮內宮頸癌的潛在診斷標志物，但其在脊柱結核病中的變化、對破骨的影響和作用機制尚不清晰[4-6]。本研究將探究miR-155-5p在脊柱結核病模型中的變化，并通過上調miR-155-5p探究其對破骨信號通路RANK/NF-κB的影響，為其在臨床脊柱結核病中發揮的作用提供理論基礎。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠，8～10周齡，雄性，體重(22±2)g，由北京維通利華實驗動物中心提供[SYXK(京)2017-0033]。

1.2 藥品與試劑 水合氯醛購自天津市申泰化學試劑有限公司，Trizol 購于美國invitrogen 公司， agomiR-155-5p及miR-NC由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，固綠染液(批號：G2551)北京索萊寶科技有限公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，Trap)染色試劑盒(批號：G1492)，北京索萊寶科技有限公司，Anti-RANK antibody (ab200369)，Anti-NF-kB p65 antibody(ab32536)，Anti-NF-kB p65(phospho S536) antibody (ab76302)，Anti-GAPDH antibody (ab8245)及二抗抗體購于美國Abcam公司。小鼠 IL-1 β ELISA試劑盒(RAB0274)、小鼠 IL-6 ELISA 試劑盒(RAB0308)、小鼠 IL-17 ELISA 試劑盒(RAB0263)、小鼠腫瘤壞死因子ELISA檢測試劑盒(RAB0477)購于美國Sigma公司。

1.3 儀器設備 ABI 7500 qPCR儀，美國ThermoFisher 公司，Leica RM2015 切片機，德國 Leica 公司，-80℃超低溫保存箱，美國 Thermo 公司，4℃冰箱，購自合肥美菱股份有限公司，SC-3610 低速離心機，購自安徽中科中佳科學儀器有限公司，美國，電子秤 AL104 瑞士METTLER TOLEDO公司，室溫離心機Eppendorf minispin 德國Eppendorf公司，Labsystems Multiskan352酶標儀 美國MS公司，DM-BA400-B 顯微鏡，美國Motic 公司，Western blot電泳儀，BIO-RAD公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠分組及飼養條件：8～10周齡雄性C57BL/6小鼠于SPF級鼠房飼養，室溫調節在(25±2)℃,相對濕度維持在40%～65%，12/12 h晝夜交替照明，自由攝取食物和飲用水，適應性飼養1周后造模。

1.4.2 小鼠脊柱結核病動物模型的建立、分組及處理：將小鼠隨機分為4組，對照組，模型組，NC組和實驗組，每組10只。模型組、NC組和實驗組采用濃度為108 CFU/ml的H37Rv標準菌株懸液0.1 ml建立脊柱結核病模型。將10%水合氯醛按照3 ml/kg的劑量腹腔注射，待小鼠麻醉后，取側臥位，將小鼠左側季肋區剃毛備皮。沿髂嵴上方垂直于椎體方向進針，針頭進入椎體后推注，將 0.1 ml混合膠的菌懸注射于模型組、NC組及實驗組，對照組注射等體積0.9%氯化鈉溶液，針頭在小鼠椎體內停留30 s，待膠凝固后，旋轉拔出針頭。造模后，NC組給予miR-NC尾靜脈注射，模型組給予miR-155-5p agomiR尾靜脈注射，對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液尾靜脈注射，8周后4組小鼠用于實驗檢測[7]。

1.4.3 小鼠骨組織Trap染色:造模成功后,將所取小鼠骨組織置于 4%多聚甲醛中固定。48 h后將骨組織樣本進行脫鈣、脫水及石蠟包埋并切片為 3 μm 厚的石蠟切片。脫蠟復水后，將切片置于Trap 孵育液反應 1 h，并進行甲基綠染液染色 5 min。切片取出純水清洗2遍后，采用95%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，透明樹脂封片[8]。

1.4.4 小鼠外周血Elisa檢測:4組小鼠通過眼眶取血0.5 ml，分離血漿后，加入酶標抗體，37℃,30 min，加入底物液，每孔100 μl,置37℃避光放置5 min,加入終止液顯色，每孔加入反應終止液50 μl終止反應,于20 min內測定實驗結果，酶聯檢測儀測定吸光度OD值，每組實驗設置3個復孔[9]。

1.4.5 小鼠外周血miR-155-5p表達水平分析:用TRizol提取mRNA后，立刻按照試劑盒進行cDNA反轉錄，反轉錄進行qPCR，擴增條件:95℃ 預變性10 min，95℃ 變性10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 20 s，共40個循環。以2-△△Ct計算miR-155-5p相對表達量。見表1。

表1 引物序列

1.4.6 Western blot 檢測蛋白的表達:對組織進行裂解收取總蛋白，進行SDS-PAGE 電泳80 V 15 min，120 V 2 h， PVDF膜轉模110 V 2.5 h，TBST 漂洗4次，5 min/次，使用5%脫脂奶粉封閉，TBST漂洗4次,5 min/次，加入一抗，二抗溫孵育后，TBST漂洗4次，5 min/次，ECL 顯色，發光儀曝光、拍照[11]。

2 結果

2.1 miR-155-5p在4組小鼠外周血中的表達水平 如圖1所示，與對照組小鼠相比，模型組和NC組小鼠小鼠外周血miR-155-5p表達顯著降低(P<0.01)，而實驗組小鼠相對于模型組和NC組小鼠miR-155-5p表達顯著升高(P<0.05)，但仍低于對照組(P>0.05)。見表2。

表2 miR-155-5p表達水平

2.2 MiR-155-5p對小鼠破骨細胞的影響 Trap 染色結果顯示與對照組小鼠相比，模型組和NC組小鼠骨小梁結構稀疏(綠色)、紊亂，出現部分骨質斷裂，破骨細胞數量增加(紅色)，而實驗組小鼠骨小梁結構稀疏有所緩解、破骨細胞數量減少。見圖1。

圖1 4組小鼠骨組織破骨細胞變化(Trap 染色×200)；A對照組；B模型組；C NC組；D試驗組

2.3 4組小鼠骨質的相關參數分析 與對照組小鼠比較，模型組和NC組小鼠出現骨小梁數目和骨小梁厚度的顯著下降(P<0.01)，而實驗組小鼠相對于模型組和NC組小鼠骨小梁數目和骨小梁厚度顯著升高(P<0.01)，但仍低于對照組(P>0.05)。見表3。

表3 MicroCT 檢測4組小鼠骨質的相關參數

2.4 4組小鼠外周血炎性因子比較 與對照組小鼠比較，模型組和NC組小鼠外周血IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α表達水平顯著升高(P<0.01)，而實驗組組小鼠相對于模型組和NC組小鼠IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α有降低趨勢，但仍顯著高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 4組小鼠外周血炎性因子比較

2.5 4組小鼠結核病灶組織RANK、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達的變化 與對照組比較，模型組和NC組小鼠外周血破骨信號分子RANK、NF-κB及NF-κB磷酸化分子p-NF-κB蛋白表達具有上升趨勢(P<0.01)，而實驗組相比于模型組和NC組出現顯著下降趨勢(P<0.01)，蛋白質相對定量進一步驗證了這種趨勢(P<0.01)。見表5。

表5 4組小鼠結核病灶組織RANK、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達的變化

2.6 miR-155-5p 靶基因的預測 miRDB軟件預測Smad2為miR-155-5p，雙熒光素報告酶實驗進一步證實靶向關系，Westernblot結果表明，與對照組比較，模型組和NC組小鼠外周血TGF-β1和Smad2表達具有下降趨勢(P<0.01)，而試驗組與模型組和NC組比較顯著上升(P<0.01)，蛋白質相對定量進一步驗證了這種趨勢(P<0.01)。見圖2，表6、7。

圖2 miR-155-5p的靶向關系

表6 4組TGF-β和Smad2蛋白表達水平比較

表7 雙熒光素酶報告實驗熒光素酶活性測定結果

3 討論

脊柱結核病是一種慢性病變，多為肺結核發展到一定程度時，經過血液傳播到脊柱以后，在椎體內或椎體周圍聚集，引起骨質破壞，形成脊柱結核，多見于胸椎和腰椎。患者可出現腰部僵硬，拾物時無法彎腰，脊柱前柱破壞比較嚴重時，形成后凸畸形，駝背，寒性膿腫，膿腫中含有大量的干酪樣物質、肉芽組織、死骨和壞死椎間盤組織。膿腫過大時，膿液可沿軟組織間隙蔓延，病變突破椎體后壁，壓迫脊髓或馬尾神經，可引起不同程度的下肢癱瘓[12,13]。

MicroRNA通常可以有多個靶基因，多集中于UTR區域，幾個miRNA也可以同時調節同一個基因,在細胞內具有多種重要的調節作用。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某個基因的表達。miR-155-5p在多種疾病的發生發展中發揮重要作用，研究表明抗Hp治療后萎縮胃黏膜組織中miR-155-5p表達水平顯著升高，miR-1296-5p、miR-155-5p在萎縮胃黏膜組織均呈低表達狀態并且二者聯合可以提高不良預后預測效能；miR-155-5p能通過抑制Sirt1表達調節滋養層細胞的遷移和侵襲從而影響子癇前期的發生，還能通過負向調控c-SKI的表達影響冠狀動脈內皮細胞增殖和膠原的合成[14-16]。本研究表明，在脊柱結核病小鼠黏膜組織中miR-155-5p出現了顯著的低表達，上調miR-155-5p表達后，可以顯著抑制外周血炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α釋放，抑制骨小梁的破壞，增加骨小梁數目和厚度，減少骨組織損傷，降低破骨細胞數量，從而發揮骨保護作用。

RANK/NF-κB是細胞內重要信號通路，RANK是從小鼠類巨噬細胞的破骨細胞前體細胞中復制出的破骨細胞分化因子受體，屬于Ⅰ型三聚化跨膜蛋白。RANK胞內區域包含多個受體相關因子結合區域，在破骨細胞的前體細胞、成熟破骨細胞、軟骨細胞等中起重要作用，其可與TRAF-1、TRAF-3、TRAF-6及IL-1、IL-6、IL-15等結合，是激活JNK、Wnt等破骨相關信號通路活性的關鍵步驟。NF-κB是一種多極性基因調控蛋白，能調節多種參與免疫反應的細胞因子、炎性介質， NF-κB活化在破骨細胞活化中起著顯著的作用，NF-κB依賴性細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 升高，骨髓源性的破骨細胞前體由此被募集[17-19]。本研究表明，脊柱結核病灶部位RANK、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達具有上升趨勢，而上調miR-155-5p后， RANK、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達具有下降趨勢，提示miR-155-5p對脊柱結核病的骨保護作用與調控RANK/NF-κB信號通路相關，并且NF-κB蛋白的磷酸化引起的信號轉導在此過程中發揮重要作用。

綜上，在脊柱結核病小鼠外周血中miR-155-5p表達顯著降低，上調miR-155-5p表達可以抑制炎性因子的釋放，對小鼠脊柱結核有保護作用，抑制破骨細胞的分化形成，增加骨小梁數目及厚度，其機制可能與RANK/NF-κB信號通路的調控和磷酸化相關。