環境DNA技術用于魚類多樣性調查的準確性初探

陳治高天翔

(1.海南熱帶海洋學院崖州灣創新研究院，海南 三亞 572022；2.浙江海洋大學水產學院，浙江 舟山 316022)

基于環境DNA技術進行魚類多樣性調查最早始于2012年，Minamoto等利用脊椎動物線粒體細胞色素b(Cytb)簡并引物，首次對河流中的魚類進行監測，共檢出6種淡水魚類[1]。之后，Thomsen等通過使用多組COI、Cytb引物對丹麥某港口的魚類多樣性進行評估，發現該海域中有15種魚類[2]。但是，Minamoto等、Thomsen等受所用通用引物的限制，能夠檢測的魚類種數仍然有限。2015年是魚類環境DNA技術發展史上的重要年份，Miya等使用880種魚類的線粒體基因組全序列設計出了一套魚類環境DNA宏條形碼通用引物(MiFish)，并基于沖繩水族館附近的海水樣品對該12S引物進行有效性驗證，累計鑒定出70個科、152個屬、共232種魚類[3]。國內方面，趙夢迪亦較早利用該12S引物對冬季中國東黃海水域的魚類多樣性進行分析，并取得了較理想的研究結果[4]。目前，部分觀點認為環境DNA技術優于傳統調查方法[5]。然而，目前使用環境DNA技術進行魚類多樣性調查的相關研究仍處于不斷探索中，該技術還有許多問題尚待解決[6]。特別是以往的魚類多樣性調查多位于海洋、河流等開放水域，缺乏準確的物種本底資料驗證環境DNA結果[5,6]。因此，為了解環境DNA技術的優缺點，方便后期基于該技術開展魚類多樣性調查，本研究擬對環境DNA技術用于魚類多樣性調查的準確性進行探究。

1 材料與方法

1.1 調查水域

青島海底世界位于青島市萊陽路2號，總建筑面積7000m2，水體4000t。館內魚種豐富，同時水質條件良好，水體中環境DNA濃度高。以青島海底世界為驗證水域，不僅能夠降低實驗難度，而且方便與已知魚類名單對比驗證。通過與海底世界工作人員交流得知，軟骨魚缸內的魚類個體較大，物種名錄最清晰。因此，本研究選取青島海底世界軟骨魚缸作為調查水域。

1.2 本底魚類鑒定

使用傳統形態學鑒定方法對放入海底世界軟骨魚缸的魚類進行鑒定。此工作由海底世界工作人員在魚種買入時完成。

1.3 水樣采集及保存

軟骨魚缸長約40m，寬約25m，最深處約7m，最淺處約0.5m，平均水深約4m。共設置5個取樣點(位于缸的四角及中間位置，取樣點編號SZG1～SZG5)，每個取樣點取3個平行樣(平行樣編號X.1～X.3，X代表SZG1～SZG5)。用直徑47mm、孔徑0.45μm的WCN硝酸纖維濾膜過濾2L水樣。濾膜用酒精常溫保存后送至華大基因青島研究院進行高通量測序。

1.4 建庫、測序及后續分析

利用高保真酶(Q5?High-Fidelity Master Mix，New England Biolabs)進行PCR 擴增以確保擴增效率和準確性。擴增引物為MiFish簡并引物，引物序列分別為F：5’-GTYGGTAAAWCTCGTGCCAGC-3’；R：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCYAGTTTG-3’。PCR擴增程序：94℃變性5min；94℃變性30s，54℃退火20s，72℃延伸30s，執行35個循環；72℃終延伸5min。此外，擴增時設置陰性對照檢測DNA污染。PCR產物經凝膠電泳檢測后，利用AMPure XP Beads(Beckman Coulter，Inc.)進行純化。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina)連接上測序所需接頭后完成文庫的構建。使用高通量測序儀進行2×250bp雙末端測序，測序平臺為華大基因BGISEQ-500RS。根據標簽序列進行樣品分離，使用solexaQA軟件對原始數據進行質量控制，去除可能存在錯誤的序列(

2 結果與分析

2.1 樣品數據產出

原始序列經拼接、剔除嵌合體、剔除低質量序列等操作后生成的去引物后序列數據量為602～16775條。稀釋曲線最終趨于平緩，表明樣品測序量足夠、測序深度已經基本覆蓋樣品中所有的物種[2]。然而，SZG5比SZG1～SZG4的數據量低一個數量級，該取樣點可能存在實驗操作方面的失誤。

表1 樣品及測序數據統計

2.2 物種注釋結果

高通量測序結果共生成164個OTUs。剔除鳥類、哺乳類、微生物、陰性對照及3%閾值下的OTUs后剩余52個OTUs。這52個OTUs中，有48個與NCBI公共數據庫參考序列相似度≥99%，成功注釋到種水平。其中，OTU-66為赤魟(Dasyatis akajei)和黃魟(Dasyatis bennetti)的復合序列，代表了2個種。剩余4個OTUs注釋到屬或科水平。與OTU-66類似，OTU-10與鈍尾鰕虎魚屬(Amblychaeturichthys)和矛尾鰕虎魚屬(Chaeturichthys)內的多個物種有相同的序列相似度，只能粗略確定該物種的階元。

2.3 環境DNA結果與本底資料的比較

海底世界軟骨魚缸共紀錄有25種魚類，環境DNA技術檢測出了其中的23種，名單見表2，有2種魚類——三點鯧和鉸口鯊(Ginglymostoma cirratum)未被檢測出。此外，環境DNA還檢測出30種其它魚類的存在：其中有7種來自海底世界其它缸，23種來源未知或不確定。由于海底世界魚種買入時未進行稱重處理，無生物量相關信息，因此本研究不做關于“序列豐度-生物量”方面的定量分析。

表2 高通量測序OTUs物種注釋結果

續表 高通量測序OTUs物種注釋結果

3 討論

3.1 環境DNA技術的高靈敏度

海底世界軟骨魚缸25種魚類中，環境DNA技術初步檢測出了其中的23種。基于形態鑒定的目標種“三點鯧”學名不明，且除OTU-52外剩余155個OTUs未比對到潛在的鯧亞目(Stromateoidei)物種，因此“三點鯧”可能鑒定有錯誤或實際并不存在于軟骨魚缸中。基于形態學鑒定的鉸口鯊(Ginglymostoma cirratum)可能也有錯誤：根據Fishbase(https://www.fishbase.se/search.php)物種分布圖可知，鉸口鯊主要分布在北美大西洋沿岸，其在西北太平洋沒有分布紀錄。環境DNA比對結果顯示，OTU-50與鉸口鯊的參考序列相似度僅96%，但與銹須鯊(Nebrius ferrugineus)參考序列相似度高達100%。同時，這2種軟骨魚類皆屬于絞口鯊科(Ginglymostomatidae)[8]。目前該科名下僅3種魚類，是比較小的一個科，關于該科物種分類也有爭議，因此鉸口鯊形態鑒定錯誤的可能性較大[8]。總體而言，基于環境DNA分析技術的目標物種檢出率約為92%。此檢出率與Miya在沖繩美之海水族館調查結果接近[3]，但高于舞鶴灣的魚類檢出率(54.8%)[7]。環境DNA不僅可靈敏地進行水體中的魚類多樣性鑒定，而且可以檢驗部分魚類的形態鑒定結果。

3.2 生物信息學分析過程中物種剔除的重要性

海底世界軟骨魚缸目標魚類僅25種，但環境DNA實際擴增出的OTUs個數多達156個，表明基于MiFish引物的環境DNA高通量測序極易擴增出氣溶膠等介質中的線粒體片段，使結果中出現大量細菌、鳥類、哺乳類等類群的OTUs[9]。故陰性對照中出現的魚種在后續分析過程中都要剔除，否則會影響結果的準確性。但僅剔除陰性對照中出現的物種仍會致使大量非目標物種殘留于結果中，需對更多的OTUs進行剔除。本研究參照Yamamoto等的建議采用3%剔除閾值[7]，在該剔除閾值下絕大多數假陽性OTUs都被成功剔除。剩余的52種OTUs序列數占總序列數的98.8%(1522709/1541200)，仍能有效反映環境DNA樣本的物種情況。本研究的結果再次表明，樣品在取樣、保存、運輸、測序過程中的污染問題較為嚴重，Yamamoto等提出的3%剔除閾值是合理的[7]。

3.3 環境DNA技術的假陽性

假陽性主要原因是污染，這由環境DNA技術的高靈敏度導致[3]。在有本底參照資料的情況下，只能確認部分OTUs的來源，如OTU-33錦鯉(Cyprinus carpio haematopterus)、OTU-37舒氏海龍(Syngnathus schlegeli)等7個OTUs來源于海底世界其它缸，暗示海底世界軟骨魚缸可能和其它缸存在水體交換。然而，OTU-10鰕虎魚科未定種1(Gobiidae sp.1)和OTU-61翼魟屬未定種(Pteroplatytrygon sp.)等23個OTU來源未知，無法確認這部分魚類存在于海底世界還是受高通量測序平臺污染產生。因此，本研究的結果暗示在無本底參考資料的情況下(如對野外開放海域進行魚類多樣性調查)，很容易將假陽性魚種誤判為水域內真實存在的魚種。解決假陽性問題主要依賴以下幾種措施：水樣采集、環境DNA保存、提取、建庫、測序過程中采取嚴格的隔離措施，防止樣品污染[10]；設置陰性對照，陰性對照數目越多，被檢出的假陽性物種就越多，多樣性分析就越準確，環境DNA實驗的每一步(水樣采集、環境DNA提取、PCR擴增、測序)最好都設置陰性對照[3]；設置較高的物種閾值，二次剔除潛在假陽性結果[7]。

3.4 環境DNA技術的假陰性

假陰性主要由以下原因造成：參考序列缺失，經過3%閾值剔除后，最高相似度≤98%的OTUs有4個，此4個OTUs由于無準確參考序列，只能大致確定其所在階元；部分魚種間條形碼片段高度同源[3]，OTU-66同時代表Dasyatis akajei-赤魟和Dasyatis bennetti-黃魟2種魚類，此外OTUs比對過程中發現，平鲉屬、蝴蝶魚屬、吻鰕虎魚屬、綠鰭魚屬等屬下存在多個物種條形碼參考序列100%相似的情況，若無本底參考資料，則很容易出現假陰性誤判；部分物種擴增效率低、檢測結果具有偶然性，MiFish對硬骨魚類擴增效率較高，對軟骨魚類則適用性很差[3]。因此，后續需進行通用引物的改進工作[11]。

4 結論

基于MiFish引物的環境DNA技術靈敏度高、物種檢出率高，可基本滿足魚類多樣性研究需求。但是，環境DNA樣品易被氣溶膠污染及產生錯誤擴增，因此務必增加陰性對照以提高結果準確性。此外，在具體海域開展魚類多樣性調查前需建立本地參考數據庫，以提高物種注釋的準確性。