簇花清風藤對慢性腎小球腎炎大鼠腎臟氧化應激和炎癥損傷的影響

龐力峰，羅舒壬，周曙光，廖 欣

(廣西壯族自治區人民醫院，廣西南寧 530022)

簇花清風藤(Sabiafasciculata)為清風藤科植物，主要分布于云南、廣西、廣東、福建等地。該植物性溫，味甘、微澀，有祛風濕、散淤消腫的功效。傳統上主要用于治療風濕骨痛、腎炎水腫、跌打損傷等疾病[1]。文獻報道簇花清風藤中含有五環三萜、黃酮、生物堿、甾體等化合物[2]。慢性腎小球腎炎(Chronic Glomerulonephritis，CGN)是一種以腎小球濾過率下降、蛋白尿等為特征的慢性腎病。有研究表明，腎小球上皮細胞和系膜細胞氧化及炎癥損傷，在CGN的發生發展中具有重要作用[3,4]。研究顯示，核轉錄因子NF-E2相關因子2 (Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是體內維持氧化還原平衡的重要調節因子，參與調控腎臟疾病中的氧化應激和炎癥狀態[5]。多項研究也證實，激活Nrf2介導的抗氧化系統具有良好的改善腎病的作用[6,7]。

有報道稱，簇花清風藤醇提取物具有良好的抗炎鎮痛活性[8]，結合其民間使用經驗及相關機制，推測其對慢性腎炎可能具有潛在的藥理作用。本研究以簇花清風藤醇提取物為對象，觀察其對阿霉素所致慢性腎小球腎炎模型大鼠中腎組織病理變化、氧化應激與炎癥損傷的影響，探討簇花清風藤醇提取物改善CGN大鼠氧化應激和炎癥反應的相關機制，為藥物開發及臨床應用提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及飼料

SPF級雄性SD大鼠，體質量180-220 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK桂2014-0002，普通飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供。大鼠飼養室溫保持在20-25℃，濕度55%左右，動物自由進食、進水，按每日12 h進行晝夜循環。

1.1.2 藥材與試劑

簇花清風藤枝葉采自廣西壯族自治區來賓市金秀瑤族自治縣，經廣西中醫藥研究院中藥資源所胡仁傳老師鑒定為簇花清風藤SabiafasciculataLecomte ex L.Chen。腎炎舒片(吉林市鹿王制藥股份有限公司，批號：202000145)，注射用阿霉素凍干粉(北京索萊寶科技有限公司，批號：202009123)。尿蛋白定量試劑盒(南京建成生物科技有限公司，批號：20200807)，尿素(UREA)血生化試劑盒(批號：141320009)，肌酐(CREA)血生化試劑盒(批號：141120017)，均購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。腫瘤壞死因子α (TNF-α)ELISA試劑盒(批號：F3056-A)，白介素1β (IL-1β) ELISA試劑盒(批號：F8655-A)，白介素6 (IL-6) ELISA試劑盒(批號：F8066-A)，均購自上海泛柯實業有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；核因子NFE2相關因子2(Nrf2)單克隆抗體、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)單克隆抗體、β-actin單克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司。辣根過氧化物標記山羊抗兔IgG H+L (HRP)、辣根過氧化物標記山羊抗鼠IgG H+L (HRP)均購自艾博抗(上海)貿易有限公司。蘇木素伊紅染液，購自北京雷根生物技術有限公司。

1.1.3 儀器

BS-600血液生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；RE100-Pro旋轉蒸發儀[大龍興創實驗儀器(北京)股份公司]；Universal 320R高速冷凍離心機(德國Hettich科學儀器有限公司)；FluorChem R化學發光成像儀(美國ProteinSimple公司)；Multiskan GO酶標儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；EG1150石蠟包埋機、RM2255組織切片機、DM2500光學顯微鏡均購自德國徠卡儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 受試藥物的制備

簇花清風藤枝葉經陰涼處干燥后切碎，稱取7 kg藥材，經95%乙醇回流提取3次，合并濾液，旋轉蒸發儀濃縮至3.5 L，濃度為2 g生藥量/mL，該濃度為簇花清風藤醇提取物高劑量給藥濃度；用蒸餾水稀釋1倍，混勻后，即為簇花清風藤低劑量給藥濃度。

1.2.2 慢性腎小球腎炎模型建立

70只SD大鼠，經適應性飼養7 d后，一次性尾靜脈注射阿霉素(7 mg/kg)制備慢性腎小球腎炎模型，再選取8只SD大鼠作為空白組，注射等量生理鹽水。動物造模后每周末收集尿液，檢測24 h尿蛋白含量，當尿蛋白含量>100 mg/24 h視為造模成功[9]。

1.2.3 分組及給藥

兩周后，取造模成功的大鼠32只，按體質量隨機分為模型組、腎炎舒(SYS，6 g/kg)組、簇花清風藤醇提取物(SF-95E)高劑量(SF-95E-20，20 g生藥/kg)組和低劑量(SF-95E-10，10 g生藥/kg)組，每組8只。各給藥組給予相應藥物，按10 mL/kg體質量灌胃給藥，每日1次，連續2周，空白組和模型組給予等量的蒸餾水。

1.2.4 尿蛋白含量檢測

末次給藥1 h后，將大鼠置于代謝籠內，收集24 h尿液，按照試劑盒說明書測定尿蛋白含量。

1.2.5 血清UREA和CREA含量的測定

末次給藥24 h后，大鼠經3%異氟烷麻醉，腹主動脈取血，4℃、3 500 r/min離心10 min，收集血清，采用全自動血液生化分析儀測定血清UREA和CREA的含量。

1.2.6 腎臟臟器指數

大鼠斷頸椎處死后，剝離雙側腎組織，稱取質量，計算臟器指數。大鼠腎臟臟器指數=大鼠雙側腎臟質量(mg)/大鼠體質量(g)。

1.2.7 腎臟TNF-α、IL-1β和IL-6含量的測定

取左側腎臟200 mg，去除血漬后，按1∶9(W∶V)的體積加入冰冷的生理鹽水中進行冰浴勻漿，將組織勻漿液于15 000 r/min離心10 min，吸取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定腎臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的含量。

1.2.8 腎組織Nrf2、iNOS蛋白表達水平的測定

取左側腎臟200 mg，去除血漬后，在液氮中研磨碎，加入含RIPA的組織蛋白裂解液冰浴裂解組織，15 000 r/min離心10 min，收集上清液即為總蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠電泳，恒壓轉膜，5%脫脂奶粉中封閉2 h，TBST洗膜，以Nrf2、iNOS一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，PBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，PBST洗膜，于化學發光成像儀內曝光。蛋白條帶采用Quantity one軟件分析灰度值，以β-actin作為內參蛋白，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值作為該目的蛋白的相對表達量。

1.2.9 腎組織病理學檢查

取右側腎臟組織，輕輕擦除表面血液，以10%中性福爾馬林溶液固定，70%-80%-95%-100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明40 min，浸蠟3 h，包埋，再進行石蠟切片。HE染色步驟如下：取切片， 100%-95%-80%-70%梯度乙醇復水，蘇木素染色液染色5 min，鹽酸酒精分化5 s，氨水返藍5 s，伊紅染液染色4 min，再于70%-80%-95%-100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。將切片置于顯微鏡下觀察腎臟病理形態變化。

1.3 統計方法

2 結果與分析

2.1 SF-95E對CGN大鼠尿蛋白含量的影響

由表1可知，給藥前，與空白組相比，模型組大鼠24 h尿蛋白含量顯著增加(P<0.05)，提示7 mg/kg阿霉素可誘導大鼠出現慢性腎炎，造模大鼠出現腎小球濾過功能障礙。經過2周給藥后，與模型組相比，SF-95E-20組、腎炎舒組大鼠24 h尿蛋白含量顯著降低(P<0.05)，而SF-95E-10組尿蛋白含量略降低，但與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)。與給藥前相比，給藥2周后腎炎舒、SF-95E各給藥組尿蛋白水平均出現明顯下調，而模型組和空白組反而升高。綜上可知，SF-95E-20具有減輕腎炎損傷、改善腎小球濾過功能的作用。

表1 SF-95E對CGN大鼠尿蛋白含量的影響Table 1 Effects of SF-95E on urine protein content in CGN rats

2.2 SF-95E對CGN大鼠血清UREA和CREA含量的影響

由圖1可知，7 mg/kg阿霉素靜脈注射后可誘導模型組大鼠血清UREA和CREA含量顯著增加，與空白組大鼠相比具有顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，經藥物干預2周后，腎炎舒、SF-95E-20可顯著降低CGN大鼠血清UREA和CREA含量(P<0.05)，說明SF-95E-20和腎炎舒均可以減輕阿霉素誘導的大鼠腎損傷。

*P<0.05 compared with blank group;#P<0.05 compared with model group

2.3 SF-95E對CGN大鼠腎臟TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子水平的影響

如表2所示，與空白組相比，模型組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，藥物干預2周后，SF-95E-20和腎炎舒均可顯著降低CGN大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，進而減輕阿霉素誘導的腎炎癥反應(P<0.05)；SF-95E-10可顯著降低大鼠腎臟組織中IL-1β和IL-6含量(P<0.05)，但對TNF-α的水平不具有顯著影響(P>0.05)。

表2 SF-95E對CGN大鼠腎臟組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響(pg/mgprot)Table 2 Effects of SF-95E on TNF-α、IL-1β and IL-6 content in kidney of CGN rats (pg/mgprot)

2.4 SF-95E對CGN大鼠腎臟Nrf2、iNOS蛋白表達水平的影響

如圖2所示，與空白組相比，模型組大鼠抗氧化相關蛋白Nrf2水平顯著降低，氧化應激炎癥相關蛋白iNOS水平顯著升高(P<0.05)，表明阿霉素通過Nrf2/iNOS體系進一步誘導了腎組織的氧化應激損傷。藥物干預2周后，與模型組相比，腎炎舒組、SF-95E-20組可顯著升高CGN大鼠腎臟組織Nrf2蛋白水平、下調iNOS蛋白水平(P<0.05)，表明腎炎舒和SF-95E-20可增強腎臟抗氧化應激能力，進而減輕腎損傷。SF-95E-10組對腎臟Nrf2、iNOS蛋白表達無顯著性影響。

*P<0.05 compared with blank group;#P<0.05 compared with model group

2.5 SF-95E對CGN大鼠腎臟臟器指數的影響

由圖3可知，與空白組相比，模型組大鼠腎臟臟器指數顯著升高(P<0.05)，表明7 mg/kg阿霉素靜脈注射后，大鼠腎臟質量減少，進一步確認了阿霉素對腎臟的損傷作用。SF-95E各給藥組的腎臟臟器指數均有不同程度的降低，但與模型組相比，無統計學差異。

*P<0.05 compared with blank group;#P<0.05 compared with model group

2.6 SF-95E對CGN大鼠腎臟組織病理變化的影響

與空白組相比，模型組大鼠腎臟腎小管變性，管腔擴張呈現紡錘狀或橢圓形，管腔內上皮細胞胞質核固縮，管腔內偶見脫落上皮細胞和細胞碎片；腎小球內細胞核固縮，明顯變小，腎小球囊腔變寬。與模型組相比，腎炎舒組和SF-95E-20組大鼠腎臟腎小管擴張程度減輕，腎小球囊腔出現不同程度減小的現象，表明SF-95E-20通過改善腎小球和腎小管功能，進而減輕阿霉素致大鼠腎損傷的作用，結果見圖4。

圖4 SF-95E對CGN大鼠腎臟病理變化的影響(200×，n=8)Fig.4 Effects of SF-95E on pathological changes of kidney in CGN rats (200×，n=8)

3 討論

慢性腎小球腎炎又稱為慢性腎炎，是由多種致病因素(如過度疲勞、細菌或病毒感染、異常應激反應、水和電解質紊亂以及藥物毒性等)引起的原發性腎小球疾病[10]，臨床主要表現為蛋白尿、高血壓、水腫等，受腎小球濾過率下降的影響，常在患者血液中發現有高水平CREA和UREA[11]。

阿霉素是一類抗腫瘤藥物，進入體內后，經腎消除可產生活性氧自由基，從而誘發腎小球上皮細胞脂質過氧化反應，破壞腎小球濾膜結構，提高蛋白濾過從而形成蛋白尿，目前已被廣泛應用于動物腎病模型研究[12,13]。本試驗通過給大鼠靜脈注射阿霉素(7 mg/kg)2周后，可形成穩定的尿蛋白水平(>100 mg/24 h)，并且誘導大鼠腎臟腎小球病理損傷以及炎癥反應，表現為iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6等蛋白的上調，以及對Nrf2介導的抗氧化系統的抑制。多項研究認為，Nrf2是治療慢性腎炎、糖尿病腎炎的關鍵靶點，通過激活Nrf2可以減輕腎氧化應激反應，平衡氧化還原體系，可有效減輕糖尿病腎病的足細胞損傷[14-17]。

簇花清風藤為瑤族民間用藥，含有豐富的藥效活性物質，如五環三萜類化合物、黃酮類化合物、生物堿、甾體化合物等。本研究發現，簇花清風藤醇提取物通過激活Nrf2抗氧化應激系統，下調下游炎癥相關蛋白iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，改善腎損傷血清學指標和腎小球病理變化，進而減輕阿霉素引起的腎小球損傷。目前，簇花清風藤醇提取物改善腎炎作用的物質基礎仍不太明確，需要結合更多分析技術手段，如HPLC-MS/MS技術，進一步闡明其具體成分以及藥物在組織中的作用特點及相應靶點。由于腎小球腎炎與基底膜、足細胞、系膜等因素有關，簇花清風藤醇提取物是否通過Nrf2信號調節系膜細胞、足細胞病變等病理過程，仍需要結合相關實驗進一步探究。

4 結論

簇花清風藤醇提取物可以激活Nrf2信號通路，平衡氧化還原體系，從抗氧化應激和減輕炎癥損傷的角度來減輕腎小球病理損傷，改善慢性腎小球腎炎疾病進展。但本研究目前仍存在作用成分不明確的不足，下階段將進一步探討簇花清風藤改善腎小球腎炎疾病的具體藥效物質基礎及其作用機制，并尋找其中活性較好的藥效組分，為其臨床相關治療提供理論依據。