結(jié)直腸癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)tricellulin促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移*

彭 鵬，張金秀，李夢(mèng)詩(shī)，覃蒙斌，孫 娟，吳晴茹，程若溪，劉詩(shī)權(quán)，黃杰安

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西南寧 530007)

結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤。在全球人類腫瘤中，結(jié)直腸癌的總發(fā)病率排名第三，死亡率排名第二。雖然多種治療手段可應(yīng)用于結(jié)直腸癌的治療，但是其預(yù)后仍然不理想，尤其是在疾病晚期[1]。因此，研究結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和尋找更有效的生物分子標(biāo)記物具有重要意義。Tricellulin，也稱為TRIC、MARVELD2，是2005年科學(xué)家通過(guò)免疫電鏡技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)的存在于三細(xì)胞連接處的緊密連接蛋白，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的分布于三細(xì)胞連接處的分子[2]。它為細(xì)胞最終構(gòu)成各種立體結(jié)構(gòu)提供支點(diǎn)，是構(gòu)成和維持細(xì)胞間黏附功能的重要結(jié)構(gòu)[3]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，tricellulin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有可能成為評(píng)估腫瘤進(jìn)展和治療的新靶點(diǎn)[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，tricellulin在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]，但是其中的分子機(jī)制尚不清楚。血管生成是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血管內(nèi)膜的基本元素，在血管新生過(guò)程中起決定作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在介導(dǎo)腫瘤血管新生、轉(zhuǎn)移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，研究tricellulin和內(nèi)皮細(xì)胞的聯(lián)系對(duì)于探索其與腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移具有重要作用。本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116過(guò)表達(dá)tricellulin，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后結(jié)直腸癌細(xì)胞MMP2、MMP7的表達(dá)及侵襲能力的變化，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC侵襲能力的影響，以探索tricellulin影響結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與慢病毒載體

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116、SW620、HCT8，正常人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。根據(jù)tricellulin基因(GeneID：NM_001038603.2)設(shè)計(jì)的重組慢病毒過(guò)表達(dá)載體LV-tricellulin和空載體LV-GFP(陰性對(duì)照)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；移液器購(gòu)自德國(guó)epppendorf公司；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；垂直電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Odyssey雙色紅外熒光成像儀購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。

1.1.3 主要材料與試劑

Transwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)皿及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液(100×)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；結(jié)晶紫購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；tricellulin兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司；IRDye?680RD Goat anti-Rabbit購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)B&D公司；嘌呤霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MMP2、MMP7 ELISA kits購(gòu)于美國(guó)CLOUD-CLONE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116、SW620、HCT8，正常人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC分別用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染

選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞鋪滿孔50%時(shí)，按照說(shuō)明書(shū)將編碼人tricellulin的過(guò)表達(dá)慢病毒載體(TRIC-OE)及空載慢病毒(NC)分別轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，運(yùn)用嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。采用western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 Western blot

將40 μg細(xì)胞蛋白和上樣緩沖液混合并變性后，上樣在12%分離膠/5%積層膠上進(jìn)行SDS-PAGE。應(yīng)用電轉(zhuǎn)移將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，濾膜經(jīng)5%脫脂奶粉-TBS溶液于室溫封閉1 h后，一抗孵育過(guò)夜。濾膜經(jīng)TBST緩沖液清洗3次后，再與熒光二抗于室溫孵育1 h。濾膜經(jīng)TBST緩沖液清洗3次后，應(yīng)用Odyssey 雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)顯影。GAPDH設(shè)置為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.4 Transwell小室檢測(cè)HCT116細(xì)胞侵襲能力

將Matrigel膠用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按照1∶8的比例稀釋，吸取50 μL鋪于上室，將鋪好的基質(zhì)膠放置到4℃冰箱包被過(guò)夜。分別將TRIC-OE、NC組細(xì)胞懸液種在上室，下室加入含20%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基，放置到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用適量甲醇將小室底膜上的細(xì)胞固定后置于0.1%結(jié)晶紫中染色。清洗后倒置風(fēng)干，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5 Transwell小室檢測(cè)TRIC-OE上清液對(duì)HUVEC細(xì)胞侵襲能力的影響

TRIC-OE在10 cm培養(yǎng)皿中長(zhǎng)至約80%匯合度時(shí)，換成6 mL新鮮的完全培養(yǎng)基。24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心5 min后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的15 mL離心管中。使用TRIC-OE上清液配制條件培養(yǎng)基(TRIC-OE-CM)，上清液∶20%FBS=8∶2。當(dāng)HUVEC細(xì)胞達(dá)到約60%匯合度時(shí)，將培養(yǎng)基換成條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后消化、離心并收集HUVEC細(xì)胞。鋪膠方法同1.2.4節(jié)，將HUVEC細(xì)胞懸液種在上室，使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，下室加入培養(yǎng)條件培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，固定、染色、拍照方法同1.2.4節(jié)。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)MMP2、MMP7的表達(dá)

各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液。根據(jù)ELISA試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)TRIC-OE、NC兩組細(xì)胞上清液中MMP2、MMP7的表達(dá)含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及A 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每孔待測(cè)品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 Tricellulin在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

Tricellulin蛋白在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW620、HCT8的表達(dá)量均高于人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460(圖1)，說(shuō)明tricellulin在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)。選擇中等量表達(dá)內(nèi)源性tricellulin蛋白及侵襲能力中等的HCT116細(xì)胞株，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 Tricellulin在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系及人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系的表達(dá)Fig.1 Expression of tricellulin in human colorectal cancer cell lines and human colonic mucosal epithelial cell lines

2.2 過(guò)表達(dá)tricellulin的鑒定

過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116，經(jīng)過(guò)篩選后獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)tricellulin的細(xì)胞株，熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)大于70%(圖2)。提取總蛋白進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，以GAPDH為參照基因，結(jié)果如圖3。Western blot的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)tricellulin 的HCT116細(xì)胞株成功構(gòu)建，此細(xì)胞株可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染tricellulin (TRIC-OE)與陰性對(duì)照組細(xì)胞(NC)內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)(250×)Fig.2 Green fluorescent protein expression in lentivirus-transfected tricellulin (TRIC-OE) and negative control cells (NC)(250×)

**indicates significant difference at P<0.01

2.3 過(guò)表達(dá)tricellulin對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與NC組相比，TRIC-OE組的侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖4，P<0.01)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)tricellulin可增強(qiáng)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力。

**indicates significant difference at P<0.01

2.4 過(guò)表達(dá)tricellulin細(xì)胞上清液對(duì)HUVEC細(xì)胞侵襲能力的影響

通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液對(duì)HUVEC細(xì)胞的侵襲能力的影響。與NC組相比，使用TRIC-OE上清液配制條件培養(yǎng)基(TRIC-OE-CM組)可使HUVEC細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯增加(圖5，P<0.01)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)tricellulin人結(jié)直腸癌細(xì)胞上清液可增強(qiáng)HUVEC細(xì)胞的侵襲能力。

2.5 過(guò)表達(dá)tricellulin細(xì)胞上清液對(duì)MMP2、MMP7表達(dá)的影響

ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中MMP2、MMP7的表達(dá)，結(jié)果顯示TRIC-OE組中MMP2、MMP7的含量明顯升高(圖6，P<0.01)，說(shuō)明tricellulin可能通過(guò)MMP2、MMP7影響HUVEC的侵襲能力。

**indicates significant difference at P<0.01

**indicates significant difference at P<0.01

3 討論

雖然多種治療手段可應(yīng)用于結(jié)直腸癌的治療，如手術(shù)、放化療、免疫治療、靶向治療等，但是結(jié)直腸癌的預(yù)后仍不佳[7]。在所有腫瘤中，結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移率位居第三，是消化內(nèi)科臨床患者的常見(jiàn)死亡原因。目前結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明。腸上皮屏障由單層細(xì)胞和細(xì)胞間連接組成，細(xì)胞間連接包括緊密連接、黏附連接、橋粒、縫隙連接[8]。越來(lái)越多的研究表明，緊密連接蛋白在腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色[9-11]。Tricellulin作為緊密連接蛋白中的一員，其主要表達(dá)在三細(xì)胞連接處。筆者在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)，tricellulin在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]，但是其異常表達(dá)對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，目前作用機(jī)制尚不明確。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多階段的過(guò)程[12]。內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成了血管的內(nèi)層，參與了血管生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)之一[13]。血管生成與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)必須依賴血管的生成來(lái)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣[14]，此外，腫瘤細(xì)胞可分泌蛋白降解酶類(如MMPs),降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)后形成腫瘤細(xì)胞移動(dòng)的通道，腫瘤細(xì)胞穿透ECM，并穿透血管壁的基底膜進(jìn)入血液循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。MMPs作為目前已知能降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，在介導(dǎo)腫瘤血管新生、轉(zhuǎn)移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。本研究通過(guò)基因工程技術(shù)調(diào)控tricellulin的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)tricellulin可增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的侵襲能力，并且其上清液可增加HUVEC細(xì)胞的侵襲能力，可能是通過(guò)增加MMP2、MMP7的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，結(jié)直腸癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)tricellulin可能通過(guò)調(diào)控MMP2、MMP7的表達(dá)促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的侵襲能力。本研究為探索tricellulin調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移提供了新的理論依據(jù)，但仍需更深入的探索。

4 結(jié)論

結(jié)直腸癌中過(guò)表達(dá)tricellulin可能通過(guò)MMP2、MMP7調(diào)控HUVEC細(xì)胞的侵襲能力，可能與腫瘤血管生成密切相關(guān)。Tricellulin有望成為結(jié)直腸癌治療的分子靶點(diǎn)。